背景目的作为一种系统性疾病,动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)影响全身大中型动脉,已经成为冠状动脉疾病(coronary artery disease, CAD)的主要病理类型。研究证实AS是一种慢性炎症性疾病,主要表现为动脉管壁脂质及纤维基质堆积,管腔狭窄。根据“损伤-反应”学说,各种AS危险因素可以导致内皮细胞(endothelialcell, EC)功能障碍和(或)脱落,随后EC表达粘附分子增加,趋化血液单核细胞及T淋巴细胞粘附。单核细胞及T淋巴细胞进入内膜下启动炎性反应,分泌一系列细胞因子,如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein, MCP)、白细胞介素(interleukin, IL)等,可进一步激活EC、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)及巨噬细胞,促进AS发展。几丁质酶3样蛋白1(chitinase3-like1, CHI3L1),又名软骨糖蛋白39、YKL-40、乳腺回归蛋白39,该蛋白质存在几丁质结合活性,但无几丁质酶活性。研究表明CHI3L1可由一系列细胞分泌,如呼吸道上皮细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肿瘤细胞、VSMCs、巨噬细胞等。CHI3L1在急慢性炎症及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)重构等疾病过程中起重要作用,如AS、支气管哮喘、高血压、糖尿病(diabetes mellitus, DM)等。虽然CHI3L1与AS关系密切,但AS患者外周血CHI3L1水平与冠状动脉狭窄病变程度存在争议。一项研究认为AS患者外周血CHI3L1水平与冠状动脉狭窄病变程度成正相关,另一项调查证实AS患者外周血CHI3L1水平与冠状动脉狭窄病变程度无关。为了进一步明确CHI3L1与CAD的关系,本研究选择行主动脉-冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass graft, CABG)时废弃的主动脉管壁组织,应用免疫组化检测CHI3L1蛋白表达,探讨人体动脉组织CHI3L1蛋白表达与AS发病机制的关系。材料方法1.研究对象(1)对象：选取2010年1月至2012年6月在山东省千佛山医院行CABG的39例患者作为研究组,其中男性患者27例,女性患者12例。对照组为11例亲属间肾脏移植手术供体者,均为男性,经入院查体均排除各种器质性疾病。(2)标本：研究组患者行CABG时留取废弃的全层主动脉组织,39例CABG取得动脉组织81块。对照组供体者行肾脏移植手术时留取废弃的肾动脉组织,11例肾脏移植取得动脉组织55块。2.生化分析所有研究组患者入院后测定静脉血浆甘油三酯(triglycerides, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、脂蛋白(a)(lipoprotein (a), Lp(a)、载脂蛋白A (apolipoprotein A, ApoA)、载脂蛋白B (apolipoprotein B, ApoB)、总胆红素(total bilirubin, TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin, DBIL)、间接胆红素(indirect bilirubin, IBIL)、等生化指标。3.冠状动脉造影所有研究组患者CABG前行冠状动脉造影(coronary angiography, CAG)检查明确冠状动脉狭窄部位、范围及程度,有无钙化及迂曲,并利用Gensini积分方法定量评价患者冠状动脉病变情况。4.组织准备及免疫组化研究组及对照组动脉管壁组织经常规固定、脱水、石蜡包埋后切片,石蜡组织切片经常规脱蜡、抗原修复、滴加兔抗人CHI3L1多克隆抗体孵育、显色后行免疫组化,并应用图像分析系统测定CHI3L1相对表达量。结果1.研究组和对照组基本情况比较研究组39例患者中合并吸烟者8例,高血压17例,DM15例。11例肾脏移植手术供体者无吸烟、高血压及DM病史。研究组患者血浆TG、TC、LDL-C及Lp(a)测定值较正常参考值显著升高,血浆HDL-C及ApoA测定值与正常参考值相比明显降低,p<0.05；血浆ApoB测定值虽然较正常参考值升高,但差异无统计学意义,p>0.05。研究组患者血浆TBIL及IBIL测定值较正常参考值显著降低,p<0.05；血浆DBIL测定值虽然较正常参考值降低,但差异无统计学意义,p>0.05。2.CAG研究组39例患者中合并左冠状动脉主干病变19例,三支病变14例,二支病变或合并左冠状动脉前降支近端病变6例。CAG提示冠状动脉均有不同程度的钙化、狭窄和迂曲,并且侧支循环建立不完全。采用Gensini积分系统进行定量积分以评价CAD严重程度,研究组39例患者Gensini积分平均为62.25±21.77(24-120)。3.研究组和对照组动脉组织CHI3L1表达研究组主动脉管壁组织经免疫组化检测均有CHI3L1表达,阳性表达主要分布于EC及VSMCs胞浆,表现为棕褐色或棕黄色,分布不均匀,呈颗粒状、片状、簇状及条纹状。对照组肾动脉管壁组织经免疫组化检测显示CHI3L1表达明显减少,着色表现为浅蓝色或无色,两者相比差异有统计学意义,p<0.05。4.研究组动脉组织CHI3L1表达量与AS主要临床危险因素的关系研究组患者CHI3L1相对表达量性别之间比较,差异无统计学意义,p>0.05；吸烟者与非吸烟者,高血压患者与非高血压患者,DM患者与非DM患者之间比较,差异均有统计学意义,p<0.05。研究组患者CHI3L1相对表达量与冠状动脉狭窄病变Gensini积分相关性分析表明两者呈正相关(r=0.611,P<0.05)。结论1.本研究利用人CABG时主动脉打孔废弃的主动脉组织为标本,检测动脉组织CHI3L1蛋白表达量较正常对照明显升高,为国内外首次报道。2.本研究采用人活体动脉组织为样本,其研究结果提高了科学性、准确性及可信度,为研究AS发病机制增加了新的途径。3.本研究显示CHI3L1蛋白表达量与AS主要临床危险因素、冠状动脉狭窄病变程度成正相关。AS主要临床危险因素可促进CHI3L1表达,CHI3L1可能通过调节AS主要临床危险因素在AS发病中起作用。背景目的动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是慢性炎症性疾病,影响全身大中型动脉,已经成为冠状动脉疾病(coronary artery disease, CAD)的主要病理类型。各种AS危险因素可以导致内皮细胞(endothelial cell, EC)功能障碍和(或)脱落,趋化血液单核细胞及T淋巴细胞进入内膜下启动炎性反应,并分泌一系列细胞因子,进一步激活EC、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)及巨噬细胞,促进AS发展。几丁质酶3样蛋白1(chitinase3-like1, CHI3L1)存在几丁质结合活性,但无几丁质酶活性。研究表明CHI3L1可由一系列细胞分泌,如呼吸道上皮细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肿瘤细胞、VSMCs,巨噬细胞等。CHI3L1在急慢性炎症及细胞外基质重构等疾病过程中起重要作用,如AS、支气管哮喘、高血压、糖尿病等。人CHI3L1主动脉组织学研究显示,AS患者主动脉组织CHI3L1高度表达,为验证临床研究结果,本研究建立动物模型进行实验研究,以验证临床人活体主动脉组织研究的结果。为此本研究构建了有效慢病毒载体,使之能够携带针对小鼠CHI3L1的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),并将慢病毒悬液局部转染ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织,观察CHI3L1基因沉默在延缓AS进展及稳定AS易损斑块中的作用。材料方法1.细胞培养人胚肾细胞系293T细胞能够表达猿猴病毒40大T抗原,有利于慢病毒生产。选择小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞作为慢病毒体外转染的靶细胞。293T细胞及RAW264.7细胞于37℃在含有10%胎牛血清、100U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin,5%CO2的DMEM中培养。2.慢病毒构建及有效靶点筛选设计4条针对小鼠CHI3L1基因的小发卡RNA (small hairpin RNA, shRNA)序列(site A、site B、site C及site D)。site A的序列为：5’-GCGACAACATGCTTAGCACATTTCAAGAGAATGTGCTAAGCATGTT GTCGCTT-3’;site B的序列为：5’-GGCCATTGACACTGGCTATGATTCAAGAGATCATAGCCAGTGTCAAT GGCCTT-3’;site C的序列为：5’-GCACTGGATTTGGATGATTTCTTCAAGAGAGAAATCATCCAAATCCA GTGCTT-3’;site D的序列为：5’-GCCAGAAGGACACTAGGTTTGTTCAAGAGACAAACCTAGTGTCCTT CTGGCTT-3’c作为阴性对照,随机不相关序列为：5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAG AACTT-3’。分别构建包含上述各干扰序列的穿梭质粒载体(pShuttle vectors),然后将pShuttle vectors与pGag/Pol、pRev、pVSV-G共同转染293T细胞。慢病毒体外转染RAW264.7细胞筛选有效干扰序列。收集培养72h及96h的RAW264.7细胞进行RT-PCR及western blot分析,了解各干扰序列的干扰效率。3.动物实验50只雄性8周龄ApoE-/-小鼠饲养于SPF级饲养室,全程高脂饮食喂饲,随机分为CHI3L1慢病毒基因沉默组及空病毒载体阴性对照组。所有ApoE-/-小鼠均行右侧颈动脉套管术,术后8周颈动脉斑块组织局部转染慢病毒悬液(滴度均为1×109TU/ml)。4.组织准备及免疫组化ApoE-/-小鼠经慢病毒转染干预4周后分离颈动脉斑块组织,经常规固定、脱水、包埋后切片。组织切片分别进行HE染色、CHI3L1免疫组化、油红O染色(冰冻切片)、天狼猩红染色、VSMCs α-actin免疫组化、CD68免疫组化。5.电镜检查ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织经3%戊二醛固定、漂洗、1%锇酸固定、脱水、Spon812包埋,然后经半薄切片定位,制作超薄切片。切片经柠檬酸铅和醋酸铀电子染色,应用JEOL-1011型透射电镜观察。6. RT-PCR分析利用RT-PCR技术分别检测RAW264.7细胞中CHI3L1mRNA表达水平及ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织中CHI3L1、TNF-α、MCP-1、IL、MMP-9mRNA表达水平。7. Western blot分析RAW264.7细胞中CHI3L1蛋白表达及ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织中CHI3L1、p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT、AKT蛋白表达水平应用western blot技术检测。结果1.慢病毒构建及有效靶点筛选慢病毒构建完成后转染RAW264.7细胞,RT-PCR分析表明site A、site B、 site C及site D干扰序列基因沉默分别减少CHI3L1mRNA表达量32%、17%、65%及30%。Western blot分析表明site A、siteB、site C及site D干扰序列基因沉默分别减少CHl3L1蛋白质表达量38%、18%、64%及14%。结果提示Site C为最有效的干扰序列,最终慢病毒悬液滴度为1×109TU/ml,用于下游ApoE-/-小鼠体内实验。2.慢病毒体内转染效应对照组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织经CHI3L1免疫组化可见阳性表达,主要分布于EC及VSMCs胞浆,表现为棕褐色或棕黄色。基因沉默组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织经免疫组化提示CHI3L1表达明显减少,表现为浅蓝色或无色。RT-PCR及western blot分析结果表明基因沉默组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织中CHI3L1mRNA及蛋白表达量较对照组ApoE-/-小鼠明显减少,两者相比差异有统计学意义,p<0.05。3.电镜检查对照组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织经电镜检查提示EC及VSMCs中存在大量脂质颗粒及胆固醇结晶,EC连接中断,VSMCs以合成型为多。基因沉默组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织经电镜检查表明EC及VSMCs中可见少量脂质颗粒及胆固醇结晶,钙化多见,EC连接及基底膜大多完整,VSMCs以收缩型为多。4.慢病毒体内转染对AS斑块构成的影响对照组ApoE-/-小鼠及基因沉默组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织中脂质相对含量分别为48.8%、35.2%,两者相比后者脂质减少27.5%；胶原相对含量分别为19.5%、29.8%,两者相比后者胶原增加53.2%；VSMCs相对含量分别为14.8%、22.5%,两者相比后者VSMCs增加51.2%；巨噬细胞相对含量分别为11.9%、7.5%,两者相比后者巨噬细胞减少36%,差异均有统计学意义,p<0.05。5.慢病毒体内转染对AS斑块炎症因子及信号转导蛋白的影响RT-PCR分析表明基因沉默组ApoE-/-小鼠较对照组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-8、MMP-9mRNA表达水平均明显减少,差异均有统计学意义,p<0.05。Western blot分析表明基因沉默组ApoE-/-小鼠较对照组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织p-ERK1/2及p-AKT蛋白表达水平均明显减少,差异均有统计学意义,p<0.05。结论1.应用RNA干扰技术可以有效构建针对小鼠CHI3L1基因的慢病毒载体。2.本研究发现ApoE-/-小鼠经慢病毒载体介导的CHI3L1基因沉默干预能够改善易损斑块稳定性,验证了临床人活体主动脉组织研究的结果。3. CHI3L1基因沉默可作为抑制AS斑块进展的一个新途径,为治疗AS提供新的思路和方法。