革兰氏阴性植物病原细菌含有高度保守的hrp基因簇,该基因簇决定其在非寄主植物上激发过敏反应(Hypersensitive response,HR)和在寄主植物上致病性,并编码形成Ⅲ型分泌系统(T3SS),将致病性效应分子注入植物细胞中,从而决定寄主植物的抗病性或感病性。植物病原黄单胞菌hrp基因簇主要由10个hrp、9个hrc(hrp-conserved)和数量不等的hpa(hrp-associated)基因组成。9个hrc基因在动植物病原细菌中高度保守,编码Ⅲ型分泌系统的核心组分。效应分子通过hrpE基因编码的Hrp pilus,经由HrpF进行转位,进入植物细胞中。hpa(hrp-associated)基因对于病菌的毒性有一定贡献,但这类基因突变并不像其它hrc基因那样可显著改变病菌在寄主上的致病性和在非寄主上的HR。除了hrpE和hrpF,hrpB纵单元的8个hrp基因的精确功能还不清楚。水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)是稻黄单胞菌种下的致病变种,引起水稻细菌性条斑病(简称条斑病)。随着杂交水稻的广泛种植,我国南方稻区水稻条斑病已成为水稻上的重要细菌病害,有些稻区重于水稻白叶枯病。因此,对条斑病菌的致病机制进行研究,对了解条斑病的危害机理并进行有效防控,具有非常重要的意义。本实验室先前的研究表明,Xoc的hrp基因簇由一个核心hrp基因簇和两个hrp调节基因组成。核心hrp基因簇含有27个hrp基因,包括9个hrc基因、10个hrp基因和8个hpa基因。两个调节基因分别是hrpG和hrpX。HrpG调控hrpA操纵单元和hrpX的转录表达,而HrpX又调控从hrpB到hrpF共5个转录单元的转录。Xoc 的 hrpB操纵单元由 5 个 hrp 基因(hrpB1,hrpB2,hrpB4,hrpB5,hrpB7)和3个hrc基因(hrcJ,hrcN,hrcT)组成,hrpB1位于hrpB转录单元的前端,其启动子区域含有完整的PIP-box(TTCGC-N15-TTCGC)。为了明确这8个基因功能,本研究通过无标记的基因缺失技术,成功敲除了 hrpB4,hrpB5,hrcN,hrpB7,hrcT基因,8个突变体丧失了在水稻上的致病性和在烟草上激发过敏反应的能力,说明它们是决定水稻条斑病菌Hrp表型的关键基因。除HrcJ和HrcT外,HrpB1,HrpB2,HrpB4,HrpB5,HrcN和HrpB7蛋白自身还可以通过T3SS进行分泌。这提示,hrp结构基因不仅仅局限于形成Ⅲ型分泌系统,部分hrp基因产物本身也通过Ⅲ型系统分泌到胞外,并且可能起到效应分子的功能。RT-PCR结果显示,hrpB转录单元对hpa2、hpaB和hpa3的转录表达有较大影响。这些为进一步研究hrp基因在病原细菌与寄主植物互作中的功能提供了科学线索。为了示踪水稻条斑病菌侵染水稻的过程,本研究将绿色荧光蛋白基因(Green Fluorescence Protein,gfp)构建于hpa1启动子下,通过同源交换,整合于Xoc基因组中。PCR和Southern杂交显示,hpa1基因启动子下整合有gfp基因,hpa1位点未发生改变。致病性测定结果显示,gfp菌株在非寄主烟草上激发过敏反应的能力和在感病水稻上的致病性并没有发生改变。Gfp标记菌株与水稻悬浮细胞互作,在荧光显微镜下可见菌体呈绿色,表明hpa1基因启动子启动了gfp基因的表达。水稻条斑病菌gfp菌株的构建,为细胞水平上研究Xoc侵染水稻的病理学过程奠定了基础。