注射乙型肝炎疫苗是目前普遍使用的病毒性肝炎预防手段,但作为肌内注射制剂,存在制作费用高、存储及运输不便、患者不易耐受及需要专业技术人员给药等问题。壳聚糖(chitosan,CS)纳米粒载体是近年来用于包裹肽类、蛋白质、寡核苷酸和治疗基因等生物大分子药物的新一类给药系统,尤其适用于口服制剂,纳米粒可以有效防止蛋白类药物在胃肠道内被酶降解,提高药物的生物利用度。 本课题根据肠道粘膜及派伊尔集合淋巴结(peyers patches,PP)的免疫学特点,将能同肠道微褶细胞上岩藻糖特异性结合的荆豆凝集素,对壳聚糖进行修饰,作为载体材料,以乙肝表面抗原为模型药物,依据“特洛伊木马原则”(Trojanhorses principle),构建小肠黏膜中派伊尔集合淋巴结定位的乙肝疫苗纳米粒口服给药系统,使疫苗穿过肠道黏膜和上皮细胞等形态学屏障,被微褶细胞摄取并定位于派伊尔集合淋巴结内。 首先采用离子交联-高压匀化法,优化处方工艺,制备了壳聚糖纳米粒,考察壳聚糖的浓度、壳聚糖与交联剂三聚磷酸钠(tripolyphosphate,TPP)质量比及匀化过程对壳聚糖纳米粒粒径及多分散系数的影响,并考察了纳米粒的得率。进一步制备了包载乙肝疫苗的纳米粒,测定其包封率和载药量。建立凝胶排阻高效液相色谱法检测乙肝疫苗,并进行相应方法学考察。采用戊二醛活化法制备凝集素化壳聚糖纳米粒,并通过凝集素特异性结合底物牛颌下腺粘蛋白(BSM)与岩藻糖对凝集素的竞争性抑制结合试验,验证凝集素在反应前后活性的保持情况。以荧光素标记纳米粒,考察凝集素修饰纳米粒在小肠派伊尔淋巴结中的吸收和摄入情况。通过对体内乙肝疫苗抗体滴度的测定,研究口服凝集素化乙肝疫苗纳米粒在体内的免疫应答反应。 一、壳聚糖纳米粒处方工艺及其药剂学特性 1、以壳聚糖为材料,采用“离子交联-高压匀化法”制备壳聚糖纳米粒,通过透射电子显微镜观察纳米粒形态较规则。用激光散射粒度仪测定纳米粒粒径,平均粒径在366.8nm,多分散系数为0.122,粒度分布较窄。 2、单因素考察发现壳聚糖的浓度、壳聚糖与TPP质量比对粒径影响较大。 3、通过实验得到比较优化制备工艺条件。最终采用制备条件为：壳聚糖浓度： 2mg/ml,(w/w),TPP:2mg/mL(w/w),交联剂滴速为0.3mL/min。磁力搅拌速度为:600r/min。 4、通过稳定性实验,发现纳米粒在放置6个月以后粒径分布变宽,但是平均粒径变化不大。 本部分确定的壳聚糖纳米粒的制备方法,相关药剂学参数的考察以及制备条件的优化均为下一部的研究积累了经验。 二、乙肝疫苗检测方法的确定及纳米粒包封率测定 1、用凝胶排阻高效液相色谱法检测乙肝疫苗的含量,乙肝疫苗保留时间在10.4min,并对其进行方法学考察。 2、以低温高速离心法测得乙肝疫苗纳米粒平均包封率在90％以上,通过SDS-PAGE电泳表明,乙肝疫苗在反应前后没有发生分子量的变化。 本部分确立了用凝胶排阻高效液相色谱法检测乙肝疫苗,简便快捷。 三、荆豆凝集素修饰的壳聚糖纳米粒的制备和相关性质考察 1、用凝胶排阻高效液相色谱法检测荆豆凝集素和牛颌下腺粘蛋白(BSM)的浓度,线性良好。 2、用戊二醛活化法制备凝集素修饰的壳聚糖纳米粒,结果表明:加入越多量的戊二醛,凝集素与纳米粒结合率越大,最大结合率在85.3±3.2％,但是存在一定的饱和现象,即戊二醛的加入量增加到一定程度,结合率反而下降。 3、BSM与岩藻糖都是荆豆凝集素的特异性结合底物,所以岩藻糖的存在会让BSM与凝集素化纳米粒的结合受到抑制。通过BSM与岩藻糖对凝集素的竞争性抑制实验,说明凝集素在结合到纳米粒表面后糖结合活性的保持。 本部分成功制备了凝集素化壳聚糖纳米粒,为派伊尔集合淋巴结定向给药提供了实验基础。 四、凝集素化纳米粒对小鼠派伊尔淋巴结的定位作用及体内应答反应 1、制备荧光素化纳米粒,灌胃给药后,剖取出小肠中派伊尔淋巴结,制成组织切片,用荧光显微镜观察发现纳米粒在淋巴结中有一定富集效果。 2、对BALB/c小鼠进行分组,分为市售制剂肌注组、口服凝集素化乙肝疫苗纳米粒组、口服乙肝疫苗未凝集素化纳米粒组、口服乙肝疫苗组、阴性对照组(生理盐水),按一定时间间隔取血,分离血清,用乙肝表面抗体检测试剂盒测定小鼠血清中抗体滴度。本部分进行体外离体实验和体内实验研究,实验结果发现：凝集素化纳米粒在小肠派伊尔淋巴结中是有富集的,并能在一定程度上引发免疫应答。 目前国内外多为凝集素对PLGA等材料进行修饰后实现对蛋白或疫苗类药物的口服给药,凝集素对壳聚糖的修饰还未有报道。本课题的研究表明,凝集素化壳聚糖纳米粒可以作为疫苗类药物有效的载体,用于派伊尔淋巴结的定向口服给药,所制备的凝集素化乙肝疫苗壳聚糖纳米粒为蛋白类药物口服给药的深入研究奠定了基础,为乙肝疫苗口服免疫开辟了新思路,也丰富了微载体给药的研究内容。