犬瘟热(Canine distemper)、犬细小病毒病(Canine parvovirus enteritis)和狂犬病(Rabies)是三种主要的在全球范围内传播的犬科、猫科动物疫病。目前针对三种疫病唯一有效的防控办法就是疫苗免疫接种,但目前在临床中使用的常规疫苗存在诸多不足之处。多表位疫苗是基于抗原表位氨基酸序列而制备的一种新型疫苗,因其安全性好、保护力强和应答类型可调控等特点,近年来备受关注。本研究的主要目的是构建CDV、CPV和RV的主要保护性抗原多表位重组蛋白,利用原核表达技术进行表达,并对其免疫原性进行研究。同时,也对新型免疫佐剂聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)的免疫增强效果进行了研究,为研制犬类CDV、CPV和RV病毒多表位重组疫苗奠定了基础。本研究通过对已报道的多个有价值的CDV、CPV和RV的T细胞和B细胞表位进行分析和评价,最终选择了 13个不同的表位用于构建多表位重组蛋白。包括CDV的2个B细胞表位,2个Th细胞表位及1个CTL细胞表位;CPV的2个B细胞表位及1个Th细胞表位;RV的2个B细胞表位,1个模拟空间B细胞表位,2个Th细胞表位及1个CTL细胞表位。各候选表位按照一定规则排列后通过连接子GGGGS或KK连接以保持各表位的独立构象。对这些重组蛋白序列的亲水性、抗原性、折叠性、表面可及性、二级结构和三级结构等进行预测分析,最终优选出6个不易形成二级结构、不易组成新表位的重组蛋白序列rP1、rP2、rP3、rP4、rP5和rP6。编码这6个蛋白的基因序列经密码子优化后进行全基因合成,再克隆至原核表达载体上,其中rP1、rP2和rP3克隆到pET-28a(+),rP4、rP5和rP6克隆到pET-30a(+)上。SDS-PAGE检测结果表明,上述重组质粒转化的BL-21(DE3)经IPTG诱导后均以包涵体的形式表达。Western blotting试验结果证明,经镍柱纯化及蛋白复性操作,成功获得了 6个含有His标签的高纯度重组蛋白。6个重组蛋白和三个灭活病毒经弗氏佐剂乳化后免疫4周龄BALB/c雌性小鼠,三免后14天采血制备鼠源多抗血清。ELISA和Western blotting试验结果显示,6个蛋白能够与各自免疫后的抗血清发生反应;同时也能和上述三种灭活病毒发生反应,证明这6个重组蛋白均具有较好的免疫原性。同时,ELISA和Western blotting结果还显示,3个灭活病毒免疫小鼠制备得到的抗血清也能与6个蛋白分别反应,即灭活病毒刺激机体产生的抗体能够与6个重组蛋白反应,这表明重组蛋白中的B表位也能够产生相应的抗体。抗体中和试验、血凝抑制(Hemagglutinationinhibition,HI)试验和快速免疫荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)证明6个重组蛋白均能同时诱发小鼠产生针对CDV、CPV和RV的中和抗体。然而与CDV、CPV灭活病毒及RV的商业化疫苗组相比,6个重组蛋白产生的中和抗体的效价较低,具有明显的统计学差异。比较6个重组蛋白在小鼠中诱导产生中和抗体的效价,结果显示相对于其他4个蛋白,rP1和rP4能够产生更高效价的中和抗体,但rP1和rP4组之间无显著差异。为了研究不同佐剂对重组蛋白免疫增强效果的差异,本研究以rP4为免疫原分别与PEI佐剂、PEI + CpG佐剂、CpG佐剂、弗氏佐剂及铝佐剂配伍,免疫4周龄BALB/c雌性小鼠,以不加佐剂组为对照。在3免后第2、4、6和8周采血制备鼠源多抗血清。ELISA检测不同时期抗血清中特异性抗体的滴度,结果表明五种佐剂均能增强rP4诱导小鼠产生特异性抗体的能力与不使用佐剂组相比差异极显著。免疫增强效果为:弗氏佐剂>PEI + CpG>PEI>铝佐剂>CpG。各佐剂组特异性抗体均持续8周不消减,而不加佐剂组在第8周时降低。ELISA分别检测不同组3免后第2周抗血清中IgG1和IgG2a抗体亚型并计算其比值。通过比值分析可知,弗氏佐剂倾向于协助rP4诱导产生细胞免疫,铝佐剂倾向于协助rP4诱导产生体液免疫,而PEI倾向于诱导rP4产生平衡的体液免疫与细胞免疫,与CpG联用时,PEI协助rP4诱导的免疫反应向细胞免疫倾斜。综上所述,本课题首次成功构建、表达和纯化出了 6个含有CDV、CPV和RV病毒B细胞表位和T细胞表位的重组表位蛋白,这6个蛋白均具有良好的免疫原性,可同时诱导小鼠产生针对三种病毒的中和抗体。同时本研究还证明,PEI+CpG作为多表位重组蛋白的佐剂具有很强的免疫增强作用。上述研究结果为CDV、CPV和RV病毒多表位重组疫苗的研究奠定了坚实基础。