目的本研究探讨miR-221对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响,继而再对结直肠癌细胞中CDKN1C/p57表达的调控作用进一步研究,期望为结直肠癌发生和发展的精确分子机制、设计合理的靶向研究和诊断治疗提供新的思路。方法1.材料：人结肠癌细胞系HT-29、lovo、SW-480、Caco2及正常对照人脐静脉内皮细胞HUVEC均由中国科学院上海生命科学院细胞库提供；由miRBase数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)和GeneBank查找基因序列,使用软件Primer-Express 2.0进行引物与探针的设计。RNU6B上游引物5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’,下游引物5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’,扩增片段长96 bp; miR-221上游引物5’-CAG CAT ACA TGA TTC CTT GTG A-3’,下游引物5’-CTT TGG TGT TTG AGA TGT TTG G-3’,扩增片段长73 bp；CDKN1C/p57mRNA 3’非翻译区(untranslated region, UTR)上游引物5’-TCTAGA GCC CAA AGA GCC C-3’,下游引物5’-TCT AGA GAT TAA ACA TTT TAT ATA AAT GAC-3’,扩增片段长262 bp；上述引物均由上海生工合成。miR-221、miR-221特异性抑制剂2’-氧甲氧化修饰的RNA寡核苷酸(anti-miR-221)、miR-221抑制剂阴性对照和转染阴性对照均购自上海吉玛制药技术有限公司。2.细胞培养及转染：细胞常规复苏后,以含10%胎牛血清(v/v)的RPMI-1640培养基(Hy clone)重悬,置于25 cm2培养瓶37℃、5%CO2孵育箱中静置培养,待细胞接触密度至80%～90%时常规胰酶消化传代,细胞传代4～8代后用于实验。转染前1 d,选择生长状态良好的CRC细胞,按3×105cells/孔的密度接种于6孔板,待细胞密度达到50%～70%后,按Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行转染(Invitrogen),设置阴性对照组、anti-miR-221阴性对照组、miR-221转染组、anti-miR-221转染组,转染试剂浓度为50nmol/L,每组设6个复孔,培养4h后换新鲜培养液。3. Real-time RT-PCR检测标本中miR-221表达：采用茎环法扩增。收集培养细胞1×107,常规Trizol试剂(Invitrogen)抽提总RNA, DEPC水溶解沉淀,核酸蛋白分析仪(Beckman Coulter, USA)测定RNA浓度,根据RNA在A260nm/A280nm≥1.8及甲醛变性凝胶电泳28 S、18 S RNA条带比值≥1.5鉴定RNA纯度及完整性。取上述步骤提取的总RNA 1μl加入无菌蒸馏水12μl,混匀后72℃孵育5 min以打开RNA二级结构,随后立即置于冰上,以防止RNA复性再次恢复二级结构；在另一去RNase的PCR管中配置以下反应液：dNTP mixture 2.0μl、RNase抑制剂0.5μl、miR-221逆转录引物0.5μl、RNU6B逆转录引物0.5μl、5xbuffer 4.0μl、M-MLV逆转录酶0.5μl(Promega);配好后加入到刚才含总RNA的溶液中混匀,42℃孵育60 min,所得cDNA置于-20℃保存。构建miR-221和RNU6B的Real-time RT-PCR反应体系：cDNA5.0μl、Primers 1.0μl、SYBR Green荧光染料10μl、无菌蒸馏水8.0ul；反应条件：95℃变性10 min；95℃15 s、65℃30 s、72℃30 s,共40个循环；循环结束后72℃延伸10 min,每个标本均作复管PCR反应(试剂购自TOYOBO公司,PCR仪采用ABI PRISM(?)7300)。采用RNU6B作为内参照,以RNU6B拷贝数作为校正基数,通过Light Cycler软件直接获得各样本中miR-221的Ct (cyclethreshold)值,与同样本中RNU6B的Ct值相减,即获得该样本中miR-221的ΔCt值；由于以Real-time RT-PCR定量RNA时,受到不同RNA样本存在不同逆转录效率的影响,遂再以正常细胞ΔCt值作为校正,得出-ΔΔCT值,按目的基因表达量=2-ΔΔcT公式计算各样本中miR-221确切含量。以上实验均至少重复三次。4. Western-blot检测CDKN1C/p57蛋白表达：培养细胞经预冷PBS漂洗2次,置于冰冷裂解液(含150mmol/L NaCl、50mmol/L Tris-HCl [pH7.6]、0.1%SDS、1%NP-40和蛋白酶抑制剂复合物)中研磨匀浆后超声破碎10 min,13000g离心10 min收集裂解物总蛋白；取50μg总蛋白行SDS-PAGE并原位电转印至PVDF膜；膜经封闭液(含20mmol/L Tris-HC1[pH7.6]、150mmol/L NaCl、0.1%Tween-20和5%脱脂奶粉)处理后,与兔抗人CDKN1C/p57和β-actin多克隆抗体分别孵育,膜经漂洗后再与羊抗兔二抗反应(一抗,二抗均购自Abcam公司),增强化学发光法(ECL)发光试剂显影得到蛋白印记条带,将CDKN1C/p57与同条件下扩增的内参照进行灰度比较以半定量分析。以上实验均至少重复三次。5.噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖：取对数生长期细胞,按1.5×104cells/孔接种细胞于96孔板,37℃、5%C02孵箱中培养12h,观察细胞贴壁后弃去培养液；细胞转染后先观察阴性对照组、anti-miR-221阴性对照组和空白对照组3组间细胞生长速度差异,在确定前两组对细胞生长无明显影响的情况下进行后继实验。以50 nmol/L的miR-221和anti-miR-221转染细胞,每组设6个复孔；常规培养48 h后取出培养板,每孔加入MTT(5g/L)20μl并继续孵育4h后弃培养液,加入二甲基亚砜(DMSO)200μl/孔,微量振荡器振荡10 min至结晶溶解,空白对照调零,酶标仪上测定490 nm波长处吸光度值(A),细胞增殖抑制率(CPIR)=(1-实验组平均A490值/空白对照组平均A490值)×100%。6.流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率：CRC细胞悬液5×105个接种于24孔培养板,贴壁后,采用常规的血清饥饿法使细胞同步化。即在实验开始前,先给予无血清培养液处理细胞24 h,然后更换为含50 nmol/L的miR-221和anti-miR-221的完全培养液处理48h后收集细胞,PBS漂洗2次,体积分数为70%的预冷乙醇固定,4℃过夜后再以PBS漂洗2次,用含有AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶的PBS在4℃黑暗条件下染色30 min后,以Coulter公司的EPICS XL型流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率。7.荧光素酶报告载体的构建和荧光素酶活性检测：从正常结肠黏膜组织中分离基因组DNA,利用PCR扩增CDKN1C/p57基因3’-UTR片段,其中即含有miR-221可能结合位点；PCR反应条件为：94℃2min；94℃30s、55℃30s、72℃1min,30个循环：72℃10min。PCR产物通过琼脂糖电泳纯化后克隆入TA克隆载体pMD-T (TaKaRa)。挑选数株细菌克隆培养并提取质粒后进行DNA测序,将序列正确的质粒备用。将重组有人CDKN1C/p57基因3’-UTR片段的pMD-T载体进行适当酶切和通过琼脂糖电泳纯化后,用T4-DNA聚合酶(TaKaRa)将两端补平,再将此片段插入经XbaI酶切的荧光素酶报告载体pGL3-Control (Promega),所制备的质粒称为pGL3-p57,挑选插入方向通过酶切鉴定正确的克隆,按Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书转染Caco2细胞(Invitrogen),同时转染50pmol的miR-221或anti-miR-221,用转染pGL3-Control空载体的Caco2细胞作为对照。细胞培养24小时后按Dual-Luciferase reporter assay system (Promega)操作手册对细胞提取物中的荧光素酶活性进行分析。以上实验均至少重复三次。8.统计学分析：实验所得数据用均数±标准差(x±s)表示,采用完全随机设计的单因素方差分析,多个样本均数间的两两比较采用Student-Newman-Keuls q检验,以P<0.05为差异具有统计学意义,所有操作以SPSS13.0统计软件完成。结果1. Real-time RT-PCR检测CRC转染后miR-221表达改变：检测癌细胞中miR-221 cDNA显示指数增长,并达到平台期,其扩增曲线为一组典型的倒S型曲线,扩增效率较高；miR-221的PCR产物为73 bp,其对应的Tm为84.26±0.56℃,熔解温度均一,峰的形状亦较锐利；通过设置复孔取平均值,即得到各样本中目的基因扩增的Ct值作为miR-221定量判定。四种人CRC细胞系HT-29、lovo、SW-480、Caco2中miR-221表达量分别为(4.094±0.208),(1.122±0.138),(3.927±0.232),(1.831±0.149),与正常对照HUVEC相比(0.223±0.047),差异均具有统计学意义(P<0.01)。我们选取miR-221基线表达水平适中的Caco2细胞系作为进一步研究对象；当目的基因转染至Caco2细胞48h后,再次应用Real-time RT-PCR检测癌细胞中miR-221表达情况,发现转染miR-221后相应miR-221表达水平明显增高(2.915±0.442),而转染anti-miR-221后相应miR-221表达水平明显下降(0.541±0.206),与基线表达水平相比差异均具有统计学意义(P<0.01),目的基因转染效率较高。2、MTT法检测anti-miR-221对Caco2细胞增殖的影响：MTT法显示NC组、anti-miR-221 NC组、miR-221转染组、anti-miR-221转染组CPIR分别为27.2±3.6%、25.8±4.1%、16.3±2.9%、59.4±4.9%,与NC组相比,miR-221转染组、anti-miR-221转染组差异均具有统计学意义(P<0.01)。3、流式细胞仪检测anti-miR-221对Caco2细胞增殖周期及凋亡的影响：转染miR-221后细胞增殖活跃,G0/G1期细胞比例明显减小,而S期细胞比例显著增高；而相应地转染anti-miR-221后细胞增殖受到抑制,G0/G1期细胞比例明显增加,而S期细胞比例显著下降,并可见明显的细胞凋亡发生,差异均具有统计学意义(P<0.01)。4、荧光素酶活性分析证实miR-221与CDKN1C/p57 mRNA结合位点：将pGL3-p57质粒与miR-221或anti-miR-221共转染Caco2细胞并培养24 h后,提取细胞裂解物进行荧光素酶活性分析。转染miR-221后荧光活性显著下降,而相应地转染anti-miR-221后荧光活性显著增高,差异均具有统计学意义(P<0.01)。5、Western-blot检测细胞转染后CDKN1C/p57蛋白表达改变：转染miR-221后Caco2细胞中CDKN1C/p57蛋白表达下降,而相应地转染anti-miR-221后细胞中CDKN1C/p57蛋白表达上调,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论1、与我们之前CRC组织标本测定结果一致,miR-221亦可高表达于多种人结直肠癌细胞株中,且转染miR-221后在相应miR-221表达水平明显增高的同时癌细胞增殖亦更加活跃,说明miR-221确实具有促进肿瘤细胞增殖的活性；而应用miR-221特异性抑制剂则可有效降低其表达水平,显著抑制了肿瘤细胞增殖,并诱导其发生凋亡,提示miR-221可作为结直肠癌基因治疗的新药理学靶点,特异性miR-221抑制剂确具有抗肿瘤效应,且此种生物学作用亦是anti-miR-221发挥抗瘤效应的作用机制之一。2、证实在人结直肠癌细胞株转染miR-221后,CDKN1C/p57表达下降,肿瘤细胞增殖更加活跃,CRC可能通过miR-221介导的CDKN1C/p57转录后基因沉默而获得增殖能力。应用miR-221特异性抑制剂后,CDKN1C/p57蛋白表达上调相应肿瘤细胞增殖受到抑制,说明上调CDKN1C/p57的表达,是miR-221抑制剂发挥抗癌作用的重要机制；3、当anti-miR-221与pGL3-p57质粒共转染Caco2细胞后荧光素酶活性增高,说明anti-miR-221可通过与Caco2细胞中基础表达的miR-221互补结合,从而抑制了miR-221与pGL3-p57质粒中CDKN1C/p57基因3’-UTR区域结合,使得质粒中报告荧光强度增加,更进一步直接确认了miR-221系通过与CDKN1C/p57 mRNA 3’-UTR区域结合而发挥转录后基因沉默效应(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。