藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶(MSR)基因CqMSRA5.1响应渗透胁迫机制研究

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藜麦作为新兴的杂粮作物,由于其全面且均衡的营养特性以及适应性强、耐贫瘠的抗逆特性,在我国以及世界范围内受到广泛关注。分离和鉴定藜麦抗逆基因,解析藜麦耐逆分子机理,进而培育抗逆、高产藜麦新品种是我国今后藜麦育种的重要方向。甲硫氨酸亚砜还原酶家族(MSR)是植物氧化还原平衡的重要成员,在植物应对非生物胁迫方面起着重要作用,但在藜麦中还未见该家族的任何报道。本研究以藜麦MSR基因家族为研究对象,鉴定并分析了CqMSR基因家族的成员组成、基因结构、进化关系以及表达模式,并进一步将CqMSRA5.1基因作为研究对象,初步探究了该基因响应渗透胁迫的分子机制。主要研究结果如下:1.CqMSR基因家族鉴定及生物信息学分析利用同源序列BLAST技术在藜麦基因组中鉴定并克隆了8个CqMSR基因,分别为MSRA家族成员:CqMSRA1.1、CqMSRA1.2、CqMSRA5.1、CqMSRA5.2以及MSRB家族成员:CqMSRB1.1、CqMSRB1.2、CqMSRB2.1、CqMSRB2.2。蛋白聚类分析结果表明CqMSRs具有典型的MSR结构域,进化上较为保守,与菠菜、甜菜亲缘关系较近。组织表达结果表明,除了CqMSRA5.1和CqMSRA5.2在叶片中表达量最高之外,其他家族成员均在茎中表达量较高。诱导表达结果表明,CqMSRs积极响应Na Cl、PEG、冷胁迫以及热胁迫诱导,其中CqMSRA5.1对于上述四种胁迫处理均显示出显著上调的表达趋势。2.CqMSRA5.1基因功能分析亚细胞定位实验结果显示CqMSRA5.1定位于叶绿体中。体外酶学性质验证实验结果表明CqMSRA5.1可特异地识别并还原S-型甲硫氨酸亚砜,属于MSRA家族成员。构建CqMSRA5.1拟南芥过表达系并进行了甘露醇模拟渗透胁迫处理以及土壤干旱处理表型实验。实验结果表明,CqMSRA5.1能够显著提高拟南芥对于渗透胁迫的抗性。通过活性氧定性、定量以及通路Marker gene检测实验结果表明,CqMSRA5.1能够显著降低拟南芥中的ROS水平。以上结果表明,CqMSRA5.1能够通过调节ROS平衡进而增强拟南芥对于渗透胁迫的抗性。3.CqMSRA5.1基因响应渗透胁迫作用机制分析利用生物信息学技术对MSRA5互作蛋白进行预测分析,谷胱甘肽合成酶2(GSH2)被预测为MSRA5的潜在互作蛋白。通过Y2H及Bi FC实验证实,藜麦谷胱甘肽合成酶2基因(GSH2)与CqMSRA5.1存在互作,通过蛋白模拟结合分析发现,互作的具体区域可能为第193位的Met残基。利用GSH特异性抑制剂BSO进行药理学表型实验结果表明,BSO能够显著抑制CqMSRA5.1的抗逆功能。以上结果表明CqMSRA5.1和CqGSH2在结构上存在互作关系,在功能以CqGSH2为底物,并通过作用与GSH-GSSG Cycle来应对渗透胁迫。总之,CqMSR基因家族对于藜麦非生物胁迫响应具有重要贡献,其中CqMSRA5.1在应对渗透胁迫过程中发挥重要作用,通过与CqGSH2的互作调节藜麦体内的ROS平衡,该结果对于藜麦抗逆育种提供了重要的理论依据,也为其他作物育种提供了耐逆基因源。
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