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第一部分大鼠肝移植冷缺血再灌注损伤模型的建立稳定、可靠的大鼠原位肝移植实验模型是研制肝脏保存液必不可少的工具。我们通过提高手术技巧、规范操作步骤、改善供体的灌注方式等途径建立了稳定的大鼠肝移植模型。将30对体重220~250克的清洁级雄性SD大鼠随机分为A,B,C三组,供肝采用4℃复方乳酸林格氏液保存,保存时间分别为5小时、6小时和7小时。供肝均保存于4℃乳酸林格氏液。供体大鼠取肝平均时间为21±0.5分钟,受体手术时间控制在26±2分钟,其中无肝期为13±0.5分钟。结果显示:5小时保存组大鼠一周存活率为90%;6小时保存组大鼠一周存活率为50%;7小时保存组大鼠一周存活率为10%。统计学上各组之间显著差异(P1=0.00,P2=0.00,P3=0.00)。大鼠肝移植缺血再灌注损伤实验模型成功建立。采用乳酸林格氏液冷保存,为体现苦参碱的保护效果应采取冷保存6小时的方法。
第二部分苦参碱加入复方乳酸林格氏液中成分稳定性的实验研究本部分研究苦参碱加入复方乳酸林格氏液中其溶液成分的稳定性。配好含苦参碱600mg·L-1的乳酸林格氏溶液备用,采用HPLC法测定成分。取苦参碱标准对照品(中国药品生物制品检定所,805-200005),在190nm~900nm波长内扫描,发现在220nm波长处有最大吸收。并测定渗透压及溶液PH值变化。样品配制后0、2、4、6、8、12、24、48h时分别在澄明度灯下检视,结果药液均澄明,无变色、气泡、结晶或浑浊发生。样品配制后0、2、4、6、8、12、24、48h时分别测定渗透压和PH值,结果48小时内渗透压和PH值均无明显变化。取样品溶液1mL,加甲醇定容至10mL,取20μL进样,HPLC测其含量。结果苦参碱在乳酸林格氏液中48h内含量基本不变,稳定性较好。结论为在室温条件下,苦参碱注射液在乳酸林格氏液中配伍后48h内,渗透压、PH值无明显变化,溶液澄明度及颜色也无变化;其含量在48h内亦相对稳定,且能保持较高的药物浓度,可以配伍使用,并且可以放置48h。
第三部分苦参碱加入复方乳酸林格氏液对肝移植大鼠的保护作用本部分将苦参碱注射液加入复方乳酸林格氏液中后用其冷保存大鼠供肝,原位肝移植后,观察、检测及比较相关实验指标,以判断苦参碱加入冷保存液中保存供体能否有效的减轻肝移植缺血再灌注损伤。为临床应用提供必要的实验依据。将54对SD大鼠随机分成假手术组(S组),单纯乳酸林格氏液保存组(U组)和苦参碱浓度为600mg/L的乳酸林格氏液保存组(T组)三组,其中U组和T组均为4℃下冷保存大鼠供肝6小时后行改良Kadama法大鼠原位肝移植术。比较各组再灌注后4小时的血清ALT,AST,LDH的含量,高效液相色谱法(HPLC)测量的肝组织匀浆的ATP含量,定磷法测Na+-K+-ATPase含量,比色法测量肝组织中的SOD、MDA含量,比较术后4小时的肝组织病理变化,以及比较术后一周各组的存活率。研究结果显示苦参碱保存组(T组)大鼠血清ALT、AST、LDH,肝组织中MDA含量均较比单纯乳酸林格氏液保存组(U组)明显降低,肝组织中SOD、ATP、Na+-K+-ATPase含量明显增高,T组的一周存活率也高于对照组;光镜电镜下肝组织病理表现T组显著优于U组。因此我们得出结论:苦参碱加入乳酸林格氏保存液保存大鼠肝脏后,可以有效减轻肝移植术后大鼠肝脏的缺血再灌注损伤,提高大鼠术后存活率。