1研究背景肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)系统作为重要的血压调控系统,在调控心血管系统生理及病理功能方面同样发挥重要的作用。血管紧张素转化酶-血管紧张素Ⅱ轴(angiotensin-converting enzyme-aniotensin Ⅱ, ACE-AngⅡ)是RAS功能重要的执行者,AngⅡ作为其主要的效应分子,参与多种疾病的病理过程,如高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死、病理性心肌重构、心力衰竭、代谢综合征等。ACE2是近年来发现的ACE同工酶,它能高效催化Ang Ⅱ转化为Ang(1-7),其催化活性比ACE水解Ang Ⅰ的活性高400倍；亦可催化Ang Ⅰ转化为Ang(1-9),而后者可进一步被ACE或其他酶继续降解成为Ang(1-7)。随着研究的不断深入,ACE2及其催化产物Ang(1-7)在心血管疾病中的作用日益明显。研究发现在新西兰大白兔动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)模型中,斑块区域血管内皮细胞和泡沫细胞中有大量ACE2蛋白的表达；而过表达ACE2可抑制AS斑块的形成,提示ACE2与AS斑块的病理发展过程密切相关。在急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)的大鼠模型中,梗死区ACE2及ACE基因的表达明显增多,免疫组化研究发现ACE2的表达主要集中于血管内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞以及心肌细胞；心力衰竭患者心肌细胞中ACE2基因表达亦增多；ACE2过表达可抑制高血压大鼠的心肌纤维化,改善左室舒张功能,而ACE2基因敲除可导致心脏功能障碍,引起血压升高、心肌收缩功能异常、心肌梗死后病理性左室重构等,这些结果提示ACE2与心脏的病理生理功能密切相关。Ang(1-7)作为ACE2的主要催化产物,被认为是Ang Ⅱ的内源性拮抗因子,可发挥扩张血管、降低血压、抑制平滑肌细胞增殖、利尿、利钠及抑制血管新生内膜增生等多种生物学功能。由此可见,ACE2及Ang(1-7)在心血管系统中发挥重要的作用,二者可通过负性调控RAS,共同维护心血管系统的稳态。因此,ACE2-Ang (1-7)可作为心血管系统疾病治疗的新靶点。尽管ACE2表达上调可对心血管疾病发挥重要的保护作用,在AS模型中,其基因调控的分子机制尚不明确。2目的(1)体外实验中,研究ACE2启动子活性区域及相应的转录因子；(2)体内实验中,探讨转录因子对ACE2的调控作用及对易损斑块的稳定作用。3方法3.1质粒构建我们用pGL3-basic报告基因载体来构建包含ACE2启动子片断的质粒。首先应用带有KPnl和Xhol内切酶双酶切位点,并含有ACE2启动子片断的引物对ACE2启动子进行扩增。我们选取了-2304至+48bp这一部分的启动子序列作为模板,通过设计不同的引物,将启动子序列逐段删减,最终得到包含10段ACE2启动子序列的片断,依次为：-2304至+48bp、-1799至+48bp、-1424至+48bp、-1236至+48bp、-1021至+48bp、-800至+48bP、-553至+48bP、-353至+48bp、-163至+48bp的PGL3-ACE2载体。为进一步获得更小片段的启动子活性区域,我们又将-353到-163bp这一部分启动子序列细分为3个片段构建PGL3-ACE2载体,依次为：-309至+48bp、-267至+48bP、-214至+48bp。3.2对细胞的转染与刺激将2ug含有ACE2启动子片断的pGL3-baisc质粒就以及pGL3-basic质粒转染进hela细胞中,在Ang Ⅱ (10-7M)刺激状态下培养24小时,进行下一步实验。3.3实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)通过RNA提取,逆转录和RT-PCR的方法对hela细胞内β-actin、荧光素酶ACE2等基因的mRNA进行检测。3.4液相色谱、质谱联用(LC-MS/MS)方法分析将生物素标记的启动子活性DNA片段与核蛋白结合后,用链霉素标记珠子下拉DNA-蛋白复合物,进行质谱检测,观察与ACE2启动子活性区域结合的转录因子。3.5 siRNA转染构建转录因子的siRNA用于hela细胞及人主动脉平滑肌细胞转染,观察各转录因子对荧光素酶、ACE2基因表达的影响。3.6染色质免疫沉淀(ChIP)分析用超声碎波将培养的细胞打碎以获取染色质片段,将抗目的蛋白的抗体与染色质片段结合后,用含有目的片段的引物进行PCR扩增,观察目的蛋白与ACE2启动子活性片段的结合能力.3.7免疫印迹(Western Blot)检测经过提取蛋白、凝胶电泳、转膜、标记一抗和二抗、ECL曝光等步骤观察目的蛋白的表达。3.8免疫共沉淀(Co-IP)分析将抗目的蛋白抗体与提取的核蛋白结合后,用western blot方法检测珠子拉下的另外一种蛋白的表达情况,验证两种蛋白之间的相互作用。3.9转录因子过表达慢病毒载体的构建构建转录因子过表达的慢病毒载体,以只携带绿色荧光蛋白GFP基因的载体作为对照病毒,转染MOVAS细胞验证转录因子过表达的效果。3.10动物模型的建立170只8周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为两大组：早期斑块组(n=75)和进展期斑块组(n=95),全程高脂喂养。(1)早期斑块组小鼠喂养4周后,经尾静脉给予不同慢病毒注射。根据转染病毒的不同,将ApoE-/-小鼠随机分4个组：(1)对照组(不加干预组,n=15)；(2)空载体组(转染只携带GFP的慢病毒,n=30); (3) NF-κB抑制因子(NKRF)组(转染携带NKRF的慢病毒,n=15); (4)CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP-β)组(转染携带C/EBP-β的慢病毒,n=15)。实验第8周末,ApoE-/-小鼠被处以安乐死。(2)进展期斑块组小鼠在高脂喂养2周后,行右侧颈总动脉套管手术用以构建AS不稳定斑块模型。套管术后6周,颈动脉局部转染慢病毒。分组同前,其中空载体组35只,其余3组每组20只。实验第12周末,全部小鼠予以安乐死。3.11体重及血脂指标的检测在实验最开始以及实验结束时对所有的ApoE-/-小鼠进行体重测量。实验结束时,经左心室穿刺采血留取血清备用。用酶学法检测血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇以及高密度脂蛋白胆固醇的水平。3.12组织病理学检测留取甲醛固定后的主动脉根部和右侧颈动脉组织制备冰冻切片,对动脉斑块组织进行H&E染色、油红O染色以及天狼猩红染色。同时,采用免疫组织化学染色的方法检测颈动脉斑块组织内平滑肌细胞、巨噬细胞以及基质金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)的含量,计算斑块易损指数。4实验结果4.1 ACE2启动子活性区域的鉴定我们用脂质体转染的方法将含有ACE2启动子片断的PGL3-basic报告载体转入hela细胞中,在Ang Ⅱ刺激下,用RT-PCR的方法检测PGL3-basic报告载体上荧光素酶的表达。结果显示转染了含有-163至+48bp启动子片断的载体后,荧光素酶的表达明显下降。将进一步缩短的启动子片段PGL3-basic报告载体转染hela细胞,再次检测荧光素酶的表达发现ACE2启动子活性区域位于-214到-163bp之间。4.2 NKRF及C/EBP-β与ACE2启动子的结合以ACE2启动子-214到-163bp段作为探针,经与核蛋白孵育结合后,将DNA-蛋白复合物进行LC-MS/MS检测。经LC-MS/MS筛选出5个可能的转录因子,即NF-κB抑制因子(NKRF)、高迁移族蛋白转录因子(BBX)、锌脂蛋白189、嗜铬粒蛋白A、C/EBP-β。分别将这5个转录因子的siRNA连同pGL3-214报告载体一起转染hela细胞后,RT-PCR检测发现干扰NKRF和C/EBP-β可明显降低荧光素酶的表达；同时,将这5个转录因子的siRNA转染人平滑肌细胞,干扰NKRF和C/EBP-β可显著降低ACE2 mRNA及蛋白的表达。在提取的人平滑肌细胞核蛋白中,用抗NKRF及C/EBP-β抗体免疫共沉淀下与之结合的DNA片段,用包含ACE2启动子-306至-144片断的引物进行PCR扩增后,可见清晰的PCR条带。同时,用siRNA干扰NKRF或C/EBP-β皆可导致二者中另外一个因子与ACE2启动子DNA序列结合能力下降。Co-IP也提示NKRF与C/EBP-β可相互结合。4.3动物一般情况两部分动物实验中各组小鼠间体重及血脂水平没有显著差别。4.4颈动脉斑块内NKRF及C/EBP-β的表达水平从颈动脉斑块组织中提取蛋白,检测斑块组织内NKRF和C/EBP-β蛋白表达的情况。结果显示,NKRF组NKRF及C/EBP-β的蛋白水平均较对照组明显升高；转染C/EBP-β过表达慢病毒可显著升高C/EBP-β的水平,但对NKRF的含量无明显影响。4.5 NKRF及C/EBP-β对ACE2表达的影响过表达NKRF及C/EBP-β均可引起颈动脉斑块组织内ACE2表达水平升高。4.6 NKRF及C/EBP-β对AS斑块成分及其易损性的影响与对照组相比,过表达NKRF及C/EBP-β均可降低斑块内巨噬细胞及脂质含量、增加平滑肌细胞及胶原的含量,进而降低易损指数。4.7 NKRF及C/EBP-β对基质金属蛋白酶表达的影响在体内实验中,免疫组化检测显示NKRF及C/EBP-β组MMP-2和MMP-9的表达水平显著低于对照组；western blot结果显示与对照组相比,C/EBP-β过表达可显著降低MMP-2和MMP-9的表达,而NKRF过表达只可明显减少MMP-9的表达,对MMP-2无显著影响。在体外实验中,western blot检测结果显示,与对照组相比过表达NKRF及C/EBP-β可显著降低MMP-9的表达,但只有C/EBP-β组MMP-2的含量明显低于对照组。4.8 NKRF及C/EBP-β对炎症因子表达的影响体内实验中western blot检测显示过表达NKRF及C/EBP-β皆可明显减少MCP-1和TNF-α的表达水平。5结论(1)ACE2启动子活性区域位于-214到-163之间,NKRF和C/EBP-β共同参与调控ACE2的表达；(2)在ApoE-1-小鼠易损斑块模型中,过表达NKRF和C/EBP-β可上调斑块内ACE2的表达,进而增加斑块的稳定性；(3)单独NKRF或C/EBP-β过表达增加斑块稳定性的机制还涉及抑制MMP2、 MMP9及炎症因子的表达。1研究背景腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)是一种慢性血管退行性疾病,好发于65岁以上的老年人群。AAA主要表现为腹主动脉永久性扩张,随着血管的扩张,血管壁基质降解,血管破裂倾向逐渐增加。美国每年有15000人因AAA破裂出血而死亡,AAA破裂已成为美国第13位死亡原因。尽管AAA发病率在逐年升高,且严重威胁人类健康,但AAA的发生、进展及破裂的机制尚不明确。目前,AAA的治疗仅局限于腔内或有创的外科手术治疗,而手术治疗也仅适用于AAA瘤体较大的患者,而动脉瘤直径较小(<5cm)的患者以及无症状或者无法耐受手术的高龄患者则无法从手术治疗中获益。因此寻找有效而且安全的药物治疗AAA的策略就显得至关重要。血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ,AngⅡ)可诱导ApoE-/-"小鼠形成AAA,因其AAA特点与人AAA相似而已成为目前研究AAA的主要动物模型。Ang Ⅱ是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)的主要效应分子,它可导致慢性炎症反应、基质降解及血管壁的重构。Ang Ⅱ曾一度被认为是RAS的终末产物,但其他血管紧张素肽也同样具有生物学效应,如Ang(1-7),主要由血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)催化Ang Ⅱ生成,可拮抗AngⅡ在心血管疾病中的有害作用,如扩张血管、降低血压、抑制平滑肌细胞增殖及血管内膜新生等；Ang(2-8),即AngⅢ,是AngⅡ在氨基肽酶催化下的降解产物,在调节血压及肾脏功能方面的作用与AngⅡ相似。近年来,AngⅡ另一降解产物Ang(3-8),即AngⅣ,引起广大关注。研究发现局部注射AngⅣ可增加中枢神经系统血液供应,改善学习和记忆认知功能；在早期及进展期动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型中,持续泵入AngⅣ可改善内皮功能,提示Ang Ⅳ可能发挥拮抗Ang Ⅱ的作用。然而也有研究发现Ang Ⅳ可激活NF-κB、上调炎症因子而发挥促炎作用,提示Ang Ⅳ有类似Ang Ⅱ的效应。现有的研究对Ang Ⅳ的作用仍存在分歧,并且尚无研究报道Ang Ⅳ在AngⅡ诱导的AAA中的作用。本研究拟探讨Ang Ⅳ在Ang Ⅱ诱导的AAA中的作用及可能机制。2 研究目的(1)在ApoE-/-小鼠中构建Ang Ⅱ诱导的AAA模型；(2)观察不同剂量的Ang Ⅳ在Ang Ⅱ所诱导的ApoE-/-小鼠AAA中的作用；(3)探讨Ang Ⅳ减少AAA形成的分子机制。3方法3.1动物模型的建立动物实验分为三部分。第一部分：探讨不同剂量的Ang Ⅳ对Ang Ⅱ诱导的AAA的影响。选取6-8周龄雄性ApoE-/-小鼠100只,高脂饮食喂养8周。在第4周,将不同试剂装入植入式胶囊渗透压泵中,然后将渗透压泵埋藏于小鼠皮下,持续恒速泵入28天。根据所给试剂的不同,将小鼠随机分为5组(每组20只)：对照组(生理盐水),未干预组(Ang Ⅱ1.44 mg/kg/d),小剂量Ang Ⅳ组(Ang Ⅱ 11.44 mg/kg/d+ Ang IV 0.72 mg/kg/d),中剂量Ang Ⅳ组(Ang Ⅱ 1.44 mg/kg/d+ Ang Ⅳ 1.44 mg /kg/d),大剂量Ang Ⅳ组(Ang Ⅱ 1.44 mg/kg/d+ Ang Ⅳ 2.88 mg/kg/d)。28天后,小鼠予以安乐死。第二部分：应用AT4R拮抗剂Divalinal-Ang Ⅳ探讨中剂量Ang Ⅳ对AAA的作用是否由AT4R介导。选取6-8周龄雄性ApoE-/-小鼠60只,高脂饮食喂养8周。在第4周,将不同试剂装入植入式胶囊渗透压泵中,然后将渗透压泵埋藏于小鼠皮下,持续恒速泵入28天。根据所给试剂的不同,将小鼠随机分为3组(每组20只)：未干预组(Ang Ⅱ1.44 mg/kg/d),中剂量Ang Ⅳ组(Ang Ⅱ 1.44 mg/kg/d+ Ang Ⅳ 1.44 mg/kg/d), Divalinal-Ang Ⅳ组(Ang Ⅱ 1.44 mg/kg/d+ Ang Ⅳ 1.44 mg /kg/d+divalinal-Ang Ⅳ 1.44 mg/kg/d)。28天后,小鼠予以安乐死。第三部分：进一步研究在没有Ang Ⅱ刺激状态下,单独应用不同剂量的AngⅣ对AAA的影响。选取6-8周龄雄性ApOE-/-小鼠80只,高脂饮食喂养8周。在第4周,将不同试剂装入植入式胶囊渗透压泵中,然后将渗透压泵埋藏于小鼠皮下,持续恒速泵入28天。根据所给试剂的不同,将小鼠随机分为4组(每组20只)：对照组(生理盐水),小剂量Ang Ⅳ组(Ang Ⅳ 0.72 mg/kg/d),中剂量Ang Ⅳ组(Ang Ⅳ 1.44 mg/kg/d),大剂量Ang Ⅳ组(Ang Ⅳ 2.88 mg/kg/d)。28天后,小鼠予以安乐死。3.2血压测量所有ApoE-/-小鼠在干预前及干预后每周末,利用小鼠鼠尾测压仪进行血压测量,对每只实验小鼠进行3次血压测量,取其血压平均值作为最终数值。3.3组织病理学检测实验结束后,将所有ApoE-/-小鼠予以安乐死,留取腹主动脉标本,并测量腹主动脉(肾动脉以上部位)的最大直径,AAA定义为腹主动脉最大直径超过正常腹主动脉直径的50%,观察AAA的形成率。制备腹主动脉冰冻切片,厚度为5 pm,进行H&E染色、Verhoeff弹力纤维染色及Masson三色染色；肾上段腹主动脉组织内MOMA-2、α SM-actin、MCP-1、IL-6、MMP-2和MMP-9的含量用免疫组织化学方法进行检测。3.4细胞培养取4-6代人平滑肌细胞进行实验。第一部分：探讨不同剂量的Ang Ⅳ对Ang Ⅱ刺激的人平滑肌细胞的作用。将细胞种于6孔板中,待细胞密度达到80%进行刺激。根据所加刺激的不同,分为4组：未干预组(Ang Ⅱ 10-7M),小剂量Ang Ⅳ组(Ang Ⅱ 10-7M+Ang Ⅳ10-9M),中剂量Ang Ⅳ组(Ang Ⅱ 10-7M+Ang Ⅳ 10-7M),大剂量Ang Ⅳ组(AngⅡ 10-7M+Ang Ⅳ 10-5M)。刺激24小时后,收集细胞。第二部分：探讨Akt信号通路在Ang Ⅳ对抗Ang Ⅱ中所发挥的作用。将细胞种于6孔板中,待细胞密度达到80%进行刺激。根据所加刺激的不同,分为3组：未干预组(Ang Ⅱ 10-7M),Ang Ⅳ组(Ang Ⅱ 10-7M+Ang Ⅳ 10-9M),AngⅣ+A6730组(Ang Ⅱ 10-7M+Ang Ⅳ 10-9M+A6730 10μM,其中A673010μM提前1个小时加入)。刺激24小时后,收集细胞。3.5 Western blot留取小鼠腹主动脉组织或者收集干预后的人平滑肌细胞提取蛋白,检测腹主动脉组织及人平滑肌细胞内Ⅰ型和Ⅲ型胶原、MMP-2、MMP-9、MCP-1、IL-6、 ICAM-1、NF-κB、Akt、p-Akt、AT1R、AT2R和AT4R蛋白的表达。3.6 RT-PCR留取小鼠腹主动脉组织或者收集干预后的人平滑肌细胞提取RNA,检测血管紧张素受体AT1R、AT2R、AT4R的表达。3.7明胶酶谱检测用非变性蛋白裂解液提取小鼠腹主动脉组织蛋白,利用MMP明胶酶谱试剂盒检测MMP-2和MMP-9的活性。4结果4.1 ApoE-/-小鼠血压变化与对照组相比,其余各组小鼠收缩压均显著升高,不同剂量的Ang IV及divalinal-Ang IV对收缩压无明显影响。4.2不同剂量AngⅣ对AAA形成的影响实验结束后,对照组、未干预组、小剂量AngⅣ、中剂量AngⅣ、大剂量AngⅣ组AAA的发生率分别为0%、87.5%、66.7%、37.5%、83.3%。与未干预组相比,中剂量AngⅣ可显著降低AAA的发生率及腹主动脉的最大直径,而大剂量AngⅣ无明显保护作用。与中剂量Ang Ⅳ相比,大剂量Ang Ⅳ处理可显著增加AAA的发生率及腹主动脉的最大直径。在无Ang Ⅱ刺激前提下,小、中、大剂量AngⅣ组均没有AAA的形成,并且三个组腹主动脉最大直径与对照组没有显著差别。4.3 H&E和Verhoff弹力纤维染色AAA动脉管壁内可见弹力纤维断裂、中断,管壁变薄,呈瘤样扩张,外膜增生肥厚,管腔内可伴有血栓形成。中剂量AngⅣ处理部分逆转了Ang Ⅱ所诱导的动脉管壁组织学的病理变化；大剂量Ang Ⅳ组动脉管壁组织学改变与未干预组无明显差别。4.4不同剂量Ang Ⅳ对动脉瘤细胞构成的影响免疫组化检测显示：与未干预组相比,小剂量及中剂量Ang Ⅳ组腹主动脉管壁内平滑肌细胞含量均明显升高,大剂量AngⅣ组无明显差别。中剂量AngⅣ组腹主动脉管壁中巨噬细胞的含量显著低于未干预组,而小剂量及大剂量AngⅣ组与未干预组没有明显差别。与中剂量AngⅣ组相比,大剂量AngⅣ处理可明显增加腹主动脉管壁内巨噬细胞的含量,而降低平滑肌细胞的含量。4.5不同剂量Ang Ⅳ对细胞外基质相关蛋白的影响Masson三色染色可见小剂量及中剂量Ang Ⅳ组腹主动脉管壁内胶原含量明显多于未干预组,而大剂量Ang Ⅳ组与未干预组无显著差别。Western blot结果显示：与未干预组相比,小剂量Ang Ⅳ处理可显著增加腹主动脉组织内Ⅲ型胶原的含量,中剂量AngⅣ处理均可显著增加腹主动脉组织内Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量,而大剂量AngⅣ组没有差别,但是大剂量AngⅣ处理可阻断中剂量AngⅣ处理对Ⅰ型和Ⅲ型胶原的增加效应。体外实验,小剂量Ang Ⅳ刺激可显著增加人平滑肌细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达,而大剂量AngⅣ组与未干预组无明显差别。与小剂量AngⅣ组相比,大剂量AngⅣ组中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达显著降低。体内试验中,免疫组织化学染色及western blot检测显示,相较于未干预组,小剂量及中剂量AngⅣ组腹主动脉组织内MMP-2和MMP-9的蛋白水平明显下降,而大剂量AngⅣ组无明显变化。明胶酶谱法检测发现小剂量及中剂量AngⅣ处理可显著降低MMP-2和MMP-9的活性,而大剂量AngⅣ处理不影响MMP-2和MMP-9的活性。与中剂量AngⅣ组相比,大剂量AngⅣ组MMP-2和MMP-9的表达和活性均明显升高。体外实验中,与未干预组相比,小剂量及中剂量Ang Ⅳ刺激可显著降低人平滑肌细胞中MMP-2的表达,而大剂量Ang Ⅳ组与未干预组无明显差别；小剂量AngⅣ刺激亦可显著降低MMP-9的表达,但中剂量及大剂量AngⅣ刺激无明显抑制效应。与小剂量Ang Ⅳ组相比,大剂量Ang Ⅳ刺激可明显上调MMP-2和MMP-9的表达。4.6不同剂量Ang Ⅳ对炎症因子表达的影响体内试验中,免疫组织化学染色显示,相较于未干预组,小剂量及中剂量AngⅣ组腹主动脉组织内MCP-1和IL-6的蛋白水平明显下降,而大剂量AngⅣ组无明显变化。Western blot检测显示中剂量AngⅣ组MCP-1、IL-6和ICAM-1的蛋白表达显著低于未干预组；小剂量AngⅣ组IL-6和ICAM-1的表达明显低于为干预组,但其MCP-1的表达与未干预组没有差别；大剂量AngⅣ组三种炎症因子的表达均与未干预组无明显差别。与中剂量AngⅣ组相比,大剂量AngⅣ组中MCP-1、IL-6和ICAM-1的蛋白表达均明显升高。体外实验中,小剂量Ang Ⅳ刺激可明显降低人平滑肌细胞中MCP-1、IL-6和ICAM-1的表达,而大剂量AngⅤ对炎症因子表达无显著影响。与小剂量AngIV组相比,大剂量AngⅤ组中MCP-1、IL-6和ICAM-1的蛋白表达均明显升高。4.7不同剂量Ang Ⅳ对Akt和NF-κB的影响体内试验中,相较于未干预组,中剂量Ang Ⅳ处理可显著增加Akt的磷酸化、降低NF-κB的表达,而大剂量Ang Ⅳ无明显作用。与中剂量Ang Ⅳ组相比,大剂量AngⅣ处理可显著降低Akt的磷酸化、增加NF-κB的表达。体外实验中,小剂量AngⅣ组中p-Akt明显多于未干预组,而NF-κB的表达明显降低；大剂量AngⅣ组与未干预组无明显差别。与小剂量AngⅣ组相比,大剂量AngⅣ刺激可显著降低Akt的磷酸化、增加NF-κB的表达。应用Akt的抑制剂A6730干预后,可消除小剂量Ang Ⅳ对胶原表达的增加作用以及对MMP-2和炎症因子的抑制作用,但对MMP-9无明显作用。4.8不同剂量Ang Ⅳ对血管紧张素受体的影响相较于未干预组,小剂量AngⅣ组AT1R mRNA的表达下降,AT2R和AT4R的mRNA的水平无明显差别,AT2R蛋白的表达明显升高,但AT1R和AT4R的蛋白表达无显著差别；中剂量Ang Ⅳ处理可显著增加AT2R和AT4R的mRNA和蛋白的水平,降低AT1R mRNA和蛋白的表达；大剂量AngⅣ处理对AT1R、AT2R和AT4R mRNA的水平无显著影响,但其AT1R蛋白的表达略低于未干预组。与中剂量AngⅣ组相比,大剂量AngⅣ组AT1R mRNA和蛋白的表达明显增加,AT4R mRNA的水平下降,AT2R和AT4R蛋白的表达均显著降低。体外实验也得到类似的结果。应用AT4R拮抗剂divalinal-Ang Ⅳ后,与中剂量AngⅣ组相比,AAA的发生率及腹主动脉最大直径无显著差别,但divalinal-Ang Ⅳ可明显降低腹主动脉瘤组织中SMC和胶原的含量,显著增加巨噬细胞、MMP-2及炎症因子的含量,从而部分逆转AngⅣ的保护作用。5结论(1) Ang Ⅳ对Ang Ⅱ诱导的AAA发挥双向作用,最佳剂量的Ang Ⅳ可减少AAA的形成；(2) Ang Ⅳ对Ang Ⅱ诱导的AAA的保护机制包括增加平滑肌细胞及胶原的含量、减少巨噬细胞的含量、抑制MMP-2和MMP-9的表达及活性、抑制炎症因子的表达；(3) Ang Ⅳ可增加AT2R和AT4R的表达、降低AT1R的表达,Ang受体表达谱的改变介导了Ang Ⅳ对Ang Ⅱ诱导的AAA的保护作用；(4) Ang Ⅳ对Ang Ⅱ诱导的AAA的保护作用的分子机制涉及Akt磷酸化的增加、NF-κB的表达的下降。