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禽流感病毒自1978年在意大利发现至今,世界各地不断爆发禽流感病毒疫情,而且自1997年出现H5NI禽流感病毒感染人并致人死亡起至今,全球共有553人感染,323人死亡,给养禽业和人类的公共卫生安全带来了巨大威胁。水禽作为流感病毒的自然宿主,感染流感病毒后不发病,也不表现出临床症状。但是2002年香港公园爆发的禽流感病毒疫情,死亡鸟类不但出现全身性的病毒感染,而且表现出了中枢神经系统紊乱的症状,大量水禽和迁徙鸟类死亡,打破了水禽和流感病毒的长期进化平衡。随后在日本、泰国和中国南方也先后分离到对水禽高致病的禽流感病毒。2006年湖北一鸭场爆发禽流感,发病鸭表现出不受控制的甩头、痉挛、失去平衡等典型的神经系统紊乱症状,我们从发病鸭脑组织中分离到一株H5N1禽流感病毒A/duck/Hubei/hangmei01/2006(hm/06)。我们对该株具有神经毒力的病毒进行了全基因组测序和遗传进化分析,研究了该病毒对宿主的致病力特性,采用比较蛋白质组学方法研究了该神经毒力病毒感染鸡脑组织和神经母细胞瘤(SK-N-SH, SK)细胞后蛋白质的差异表达情况,以试图揭示神经毒力H5N1禽流感病毒与宿主的相互作用机理以及致宿主神经病理发生的机制。另外,我们采用Solexaa高通量测序方法检测了神经毒力H5N1禽流感病毒和2009甲型H1N1病毒混合感染小鼠后,小鼠肺脏转录组的特性,为揭示流感病毒混合感染对宿主的致病机制奠定了基础。主要研究内容如下：1神经毒力H5N1禽流感病毒hm/06的全基因组测序及遗传进化分析我们从发病鸭脑组织中分离到一株能够造成临床感染鸭出现典型中枢神经系统紊乱症状的H5N1禽流感病毒,并进行了病毒的全基因组序列。序列分析发现,该病毒的HA切割位点为‘’SPQRERRRKR",符合高致病性禽流感病毒的特性,但是和2004年在越南、泰国、中国南方分离的毒株“PQRERRRKKR’相比,有一个赖氨酸(K)的缺失。该病毒HA蛋白受体结合位点222和224位分别为谷氨酰胺和甘氨酸,保持着禽流感病毒的受体结合特性。另外,病毒NA基因在49-69位有20个氨基酸的缺失,NS1蛋白80-84位也有5个氨基酸的缺失。对该毒株基因组的遗传进化分析发现,病毒与2005年在中国南方流行的Fujian-like亚系流感病毒高度同源,HA基因的clade为2.3.4,是现在H5N1流感病毒最流行的4个病毒亚系之一。该病毒的PB1、PA、HA、NP、M和NS基因都与2006年广东人身上分离的毒株A/China/GD01/2006同源性最高,NA和PB2基因同源性最高的病毒分别是A/duck/Fujian/1734/2005和A/chicken/zhej iang/24/2005。表明Fujian-like亚系病毒可能已经从中国南方传播到了中部中国。2神经毒力H5N1禽流感病毒hm/06对鸡胚、鸡、小鼠及鸭的致病力研究为了检测神经毒力禽流感病毒对鸡胚、鸡及小鼠的致病力,我们检测了病毒的EID50、IVCP和LD50。结果表明该毒株对鸡胚、鸡以及小鼠都表现出高致病力特性。同时,我们做了该毒株对鸭的回归实验,攻毒鸭表现出与临床病死鸭相同的中枢神经系统紊乱症状。感染鸭的病毒脏器分布表明,病死鸭的脑组织中病毒的含量很高,而且大部分病死鸭的脑组织都分离到了病毒。与传统的禽流感病毒感染鸭的主要靶器官是肠道和肺脏不同,大部分病死鸭的肺脏中都没有分离到病毒或者病毒含量很低。表明神经毒力禽流感病毒感染鸭的主要靶器官是脑组织,而这可能和该病毒对宿主的神经嗜性有关。3神经毒力H5N1禽流感病毒hm/06感染鸡脑组织神经病理模型的构建为了进一步研究神经毒力禽流感病毒对宿主的致病力,我们检测了hm/06病毒感染鸡脑组织后的病理变化。病毒感染鸡后,大部分鸡也变现出神经症状,鸡脑组织中也分离到流感病毒。病理研究表明,鸡脑组织出现典型的病毒性非化脓性脑炎病理症状。感染鸡脑组织出现脑膜充血、肿胀、脱落,脑实质出现嗜神经现象和卫星现象,脑血管出现袖套现象,另外也观察到脑组织胶质细胞浸润和髓鞘的变性和断裂。免疫组化研究证实流感病毒感染了鸡大脑和小脑组织,TUNEL染色也表明感染病毒后大脑和小脑组织中的胶质细胞出现明显的凋亡现象。4神经毒力H5N1禽流感病毒hm/06感染鸡脑组织和神经细胞比较蛋白组学研究我们采用蛋白质组学方法研究神经毒力禽流感病毒hm/06与宿主的相互作用以及病毒引起的鸡脑组织和神经母细胞瘤SK细胞蛋白的表达变化。同时我们选择了一株没有表现出神经毒力的H5N1禽流感病毒感染SK细胞提取蛋白进行蛋白质组学研究作为对照。通过双向电泳及蛋白质谱鉴定,我们鉴定出一系列病毒感染后鸡脑组织和神经细胞差异表达的蛋白,鸡脑组织和神经细胞差异表达的蛋白并不完全相同。无神经毒力的流感病毒感染SK细胞后的差异蛋白与hm/06毒株造成的差异蛋白也有差异。通过对差异蛋白进行分类和功能分析发现,差异表达的蛋白主要参与了细胞骨架系统蛋白的调节、泛素介导的蛋白降解途径、神经信号转导调节、大分子生物合成及代谢、蛋白的运输及修饰等。值得注意的是,一些差异蛋白参与了神经的信号转导及轴突的形态及功能稳定,还有一些差异蛋白参与了Huntington疾病的神经病理发生过程。5 Cdk5蛋白酶抑制剂和siRNA对hm/06病毒引起SK细胞凋亡的抑制采用蛋白c-Abl和Cdk5的蛋白酶抑制剂和siRNA抑制其表达活性,通过TUNEL染色和western blot方法检测接种hm/06病毒后SK细胞的凋亡情况和蛋白caspase的表达。结果表明Cdk5的蛋白酶抑制剂和siRNA可以抑制其表达活性,而SK细胞的凋亡及caspase的表达也受到抑制。表明Cdk5可能参与了hm/06引起的神经细胞的凋亡。6 HSN1禽流感病毒和H1N1/2009甲型流感混合感染的小鼠肺组织转录组测序对H5N1禽流感病毒和H1N1/2009甲型流感病毒混合感染的小鼠肺脏组织进行Solexa高通量测序,检测病毒混合感染后小鼠肺组织的转录组的变化情况。筛选到了大量的与病毒病毒混合感染相关的差异表达的基因,同时还检测到了很多基因发生了不同形式的选择性剪切情况,差异表达的基因和选择性剪切转录本参与了细胞内不同的生物学过程。这些差异基因和基因的选择性剪切表达可能与病毒混合感染后的高毒力及致病机理有关。