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光合效率是影响绿色植物产量与生物量的重要因素。本课题组前期克隆并命名了一个与水稻叶色相关的高光效基因NRPC,比对获得拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtNRPC1基因。拟南芥atnrpc1突变体的叶色和角果都呈现出深绿色,并且发现拟南芥AtNRPC1可以和转录因子At GLKs相互作用。基于前期实验室研究基础,克隆了拟南芥AtNRPC1的同源基因AtNRPC2与AtNRPC3,初步对拟南芥AtNRPC2、AtNRPC3进行功能与表达分析。并且对拟南芥atnrpc2、atnrpc3突变体及AtNRPC2-OE、AtNRPC3-OE过表达株系进行表型鉴定、光合色素含量、光合速率、产量和生物量的测定,深入探究了拟南芥AtNRPC2与AtNRPC3基因的生物学功能,系统分析了AtNRPCs对拟南芥生长发育的影响。另外,比对OsNRPC1基因序列,克隆了蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)MtNRPCs基因,并对蒺藜苜蓿Mt NRPCs基因进行功能与表达分析。根据蒺藜苜蓿MtNRPCs基因组序列扩增得到紫花苜蓿MsNRPCs,构建了紫花苜蓿MsNRPCs的CRISPR/Cas9敲除载体,建立了完整、成熟的紫花苜蓿转基因体系,鉴定得到了MsNRPC1与MsNRPC2双敲除载体成功转化的紫花苜蓿(Medicago sativa L.)小苗。首先,根据Os NRPC1基因序列同源克隆了拟南芥AtNRPC2、AtNRPC3基因,酵母双杂交实验证明AtNRPC2与AtGLK1互相作用,AtNRPC3分别与AtGLK1、AtGLK2存在相互作用。实时荧光定量PCR表明AtNRPC2、AtNRPC3基因在成熟期野生型植株组织特异性表达,并且这两个基因具有不同的表达模式。构建AtNRPC2和AtNRPC3的基因敲除载体和过表达载体,使用转基因方法获得了atnrpc2、atnrpc3突变体及AtNRPC2-OE、AtNRPC3-OE过表达株系。将atnrpc2、atnrpc3与对应的AtNRPC2-OE、AtNRPC3-OE及野生型株系对比,发现atnrpc2与atnrpc3突变体的叶片和角果都比野生型及相应的过表达株系更加绿,其中atnrpc2突变体比atnrpc3突变体的叶片颜色更深绿。将AtNRPC2-OE与AtNRPC3-OE过表达株系与相应的基因敲除突变体及野生型进行比较,可以看出过表达株系明显长势矮小,并且植株和果实呈现黄绿表型。光合色素含量测定发现,拟南芥在不同生长时期,与野生型相比,atnrpc2、atnrpc3突变体莲座叶及角果(成熟期)的光合色素积累量明显增加,并且抽薹期时,atnrpc2、atnrpc3突变体莲座叶光合作用能力也显著增强,AtNRPC2-OE、AtNRPC3-OE则与之相反。测定拟南芥生物量及产量发现atnrpc2、atnrpc3单株鲜重分别为2.27 g、2.01g,均明显高于WT单株鲜重的1.61 g,AtNRPC2-OE、AtNRPC3-OE单株鲜重分别为1.37 g、1.22 g,明显低于WT及突变体;atnrpc2、atnrpc3单株干重分别为0.61 g、0.54 g,明显高于WT的单株干重0.33 g,AtNRPC2-OE、AtNRPC3-OE单株干重分别为0.19 g、0.25 g,明显低于WT及突变体。与此结果一致的是这五个株系的角果数和千粒重。这些结果表明AtNRPC2与AtNRPC3负调控拟南芥的生物量和产量。紫花苜蓿由于其高生产力、高饲料价值以及在土壤改良和土壤保护中的潜在作用,已成为世界上最重要的作物之一。但是目前,我国苜蓿产业仍存在大量进口,发展相对滞后等问题,紫花苜蓿高光效育种对于我国苜蓿产业发展具有十分重要的意义。通过同源比对OsNRPC1克隆了蒺藜苜蓿MtNRPC1、MtNRPC2、MtNRPC3基因,qPCR组织特异性表达表明蒺藜苜蓿MtNRPC1、MtNRPC2、MtNRPC3基因在成熟期野生型植株中具有不同的表达模式,通过酵母双杂交实验证明蒺藜苜蓿MtNRPC1、MtNRPC2、MtNRPC3蛋白分别与MtGLK1蛋白存在相互作用。分别构建了紫花苜蓿MsNRPC1与MsNRPC2双基因敲除CRISPR/Cas9载体与Ms NRPC3单基因敲除载体。通过农杆菌介导的遗传转化技术,将MsNRPC1与MsNRPC2双敲除载体与MsNRPC3单基因敲除载体转化到紫花苜蓿中。潮霉素标记引物鉴定证明部分MsNRPC1与MsNRPC2双敲除载体已成功转化到野生型紫花苜蓿中。综上所述,拟南芥AtNRPC2、AtNRPC3蛋白与AtGLKs蛋白相互作用,AtNRPC2、AtNRPC3通过介导At GLKs负调节叶绿素合成和捕光系统所需基因的表达,影响拟南芥叶绿体发育和光合作用。AtNRPCs不存在功能冗余,与课题组前期鉴定的同源基因AtNRPC1功能相似,AtNRPC2和AtNRPC3不仅影响叶绿体发育,而且会导致拟南芥生物量及产量显著增加,这将对植物高光效育种以提高植物产量产生积极影响。此外,实验证明,蒺藜苜蓿MtNRPCs基因组织特异性表达,MtNRPC1、MtNRPC2、MtNRPC3蛋白分别与MtGLK1蛋白存在相互作用。建立系统且成熟的紫花苜蓿转基因体系,通过农杆菌介导法,得到MsNRPC1与MsNRPC2双敲除载体转化成功的紫花苜蓿小苗,为后续紫花苜蓿高光效育种创制了重要的遗传材料。