帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是以黑质多巴胺能神经元变性缺失和神经元内路易小体形成为特征的中老年常见神经系统变性疾病,临床表现包括运动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势步态障碍等。随着人口老龄化进程的加剧,PD已成为严重影响老年人群生活质量的社会问题。目前针对PD的治疗主要以改善症状为主,不能阻止或逆转该病的进展。越来越多的研究认为,内质网应激是PD发病机制中的重要环节,且内质网应激可能在PD病变的早期可能起到更为重要的作用,持续的内质网应激可导致细胞凋亡。通过干预内质网应激或为PD新的治疗策略。脑内存在相对独立的肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin-system, RAS),在中脑多巴胺能神经元中可见血管紧张素Ⅱ (Ang Ⅱ AT1受体和AT2受体表达。研究发现,Ang Ⅱ与PD多巴胺能神经元损伤存在密切关系。Ang Ⅱ能够通过AT1受体加剧多巴胺能神经元死亡,Ang Ⅱ AT1受体阻断剂(ARB)能够阻断6-OHDA或MPTP的多巴胺能神经元的毒性作用。但是具体机制尚不清楚。鱼藤酮具有脂溶性,不仅能够特异性损伤多巴胺能神经元,而且在神经元内有α-共核蛋白沉积,因此,鱼藤酮模型更接近PD病理改变。基本区域亮氨酸拉链(bZIP)转录因子家族成员的活化转录因子4(ATF4)是内质网应激的主要效应因子之一。研究发现,PD患者中脑组织ATF4上游主要激活因子磷酸化eIF2a表达增高。ATF4在PD发病机制中的作用尚不清楚,ATF4调控细胞存活是由控制下游因子决定。一方面,ATF4能够诱导转录因子CHOP表达增加,进而激活Puma,导致细胞凋亡,ATF4-CHOP-Puma被认为是内质网应激导致神经元凋亡的重要信号通路。另一方面,ATF4亦可调节泛素E3连接酶parkin的表达,而parkin的功能失调能够导致神经细胞死亡。因此,调节ATF4的表达,对于控制神经细胞的存活至关重要。本研究第一部分工作,采用对毒物刺激反应较稳定的Lewis大鼠,利用微量渗透泵缓慢注入鱼藤酮制备PD大鼠模型,同时予坎地沙坦酯治疗,观察坎地沙坦酯对PD大鼠运动功能、中脑黑质多巴胺能神经元数量及α-共核蛋白沉积的影响。同时,我们研究坎地沙坦酯对大鼠中脑内质网应激的变化,观察坎地沙坦酯对ATF4-CHOP-Puma通路的影响,探索坎地沙坦酯对鱼藤酮诱导多巴胺能神经元保护机制。为了进一步分析ATF4在神经元凋亡中的作用,我们采用了能够特异性抑制p-eIF2α去磷酸化的药物salubrinal。观察salubrinal对鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞的作用,并探讨ATF4调控下游信号因子在调节细胞存活的机制。第一部分坎地沙坦酯对鱼藤酮诱导PD大鼠多巴胺能神经元的保护作用及机制研究目的：研究坎地沙坦强酯对鱼藤酮诱导PD大鼠多巴胺能神经元损伤的保护作用及机制方法：10周龄Lewis雄性大鼠随机分为对照组、鱼藤酮组、鱼藤酮+坎地沙坦酯组及坎地沙坦酯组。鱼藤酮(2.5-3.0mg/kg·d)溶于等体积二甲亚砜(DMSO)和聚乙二醇(PEG-300)溶剂中,将充填有鱼藤酮的微泵埋置入实验动物背部皮下。对照组及坎地沙坦酯组给予等质量的生理盐水,装于微量渗透泵中。坎地沙坦酯混于0.5%甲基纤维素中进行灌胃(1mg/kg·d).4周后,分别评估大鼠体重、血压和行为学变化。免疫组织化学染色观察中脑黑质TH阳性细胞变化和α-共核蛋白表达情况；Western blotting检测上述脑区酪氨酸羟化酶表达、内质网应激相关蛋白(GRP78、ATF4、CHOP、Puma)及cleaved caspase-3的表达情况。RT-PCR检测内质网应激相关基因的表达情况。结果：(1)相对于鱼藤酮组,坎地沙坦酯能够抑制鱼藤酮所致体重减轻,改善动物运动症状。小剂量的坎地沙坦酯对各组大鼠血压无明显影响。(2)与鱼藤酮组相比,坎地沙坦酯能减少大鼠中脑黑质TH细胞死亡；同时,坎地沙坦酯能够逆转上述脑区TH表达的下调；坎地沙坦酯治疗组大鼠中脑黑质洳共核蛋白表达亦明显减少。(3)鱼藤酮损伤大鼠模型中脑黑质区存在内质网应激,GRP78、ATF4、CHOP、Puma蛋白和基因均表达增加；坎地沙坦酯能够有效抑制上述蛋白和基因的增加。另外,Western blotting分析发现坎地沙坦酯减少cleaved caspase-3水平。结论：1、坎地沙坦酯能够改善鱼藤酮诱导大鼠行为学和病理学损伤,发挥神经保护作用。2、坎地沙坦酯神经保护作用的机制涉及抑制ATF4-CHOP-Puma信号通路,减少内质网应激导致的细胞凋亡。第二部分Salubrinal在鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的作用及机制研究目的：研究salubrinal在鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞损伤中的作用及机制。方法：培养SH-SY5Y细胞,给予鱼藤酮(100nM)建立损伤模型,研究salubrinal对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞损伤作用的调节。MTT法检测鱼藤酮和salubrinal对SH-SY5Y细胞活力的影响。流式细胞仪检测鱼藤酮和salubrinal对SH-SY5Y细胞凋亡；Western blotting检测蛋白内质网应激相关蛋白表达；采用siRNA干扰ATF4、parkin表达,分析ATF4-parkin通路在调节细胞凋亡中的作用。结果：(1)鱼藤酮作用时间>6h, Western blotti(?)g分析发现GRP78、CHOP表达明显增高,cleaved caspase-3表达亦显著增加,说明内质网应激参与鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞凋亡。(2)鱼藤酮作用时间611、12h时,流式细胞仪检测发现salubrinal能有效减少细胞凋亡；同时, western blotting分析显示cleaved caspase-3表达降低。(3)通过siRNA抑制ATF4表达后,salubrinal对细胞的保护作用减弱,同时下游蛋白CHOP> parkin表达降低；敲除parkin后,salubrinal对细胞的保护作用亦减弱。另外,salubrinal作用12h后,介导CHOP核内转移的LIP表达降低。结论：1%Salubrinal能够减轻鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞损伤。2、ATF4-parkin通路是保护DA能神经元、治疗PD的重要靶点,Salubrinal可通过上调ATF、parkin水平可以有效减少鱼藤酮所致的细胞凋亡。本研究为PD的对因治疗提供新的策略。综上所述,本文的主要创新之处在于：1、坎地沙坦醣对鱼藤酮致PD大鼠具有保护作用坎地沙坦酯能够改善运动功能,减少中脑黑质多巴胺能神经元的凋亡,降低黑质区α-共核蛋白的表达,鱼藤酮诱导PD大鼠中脑黑质区存在内质网应激并导致多巴胺能神经元缺失,而坎地沙坦酯能够通过ATF4-CHOP-Puma通过减少细胞凋亡2、Salubrinal对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞具有保护作用Salubrinal能够减少鱼藤酬导致的SH-SY5Y细胞凋亡,分子机制可能与salubrinal增加ATF4、parkin表达水平,减少CHOP的核内转移有关。