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目的:本实验通过给SD大鼠饮用不同浓度氟离子水建立氟中毒大鼠模型,在大鼠染氟6个月后进行为期一周的雷帕霉素(rapamycin,RAP)和氯喹(chloroquine,CQ)的腹腔注射,分别作自噬激动剂组及自噬抑制剂组;分别检测氟中毒组、自噬激动剂组和自噬抑制剂组的自噬相关蛋白(LC-3B、Beclin-1)及肝纤维化相关蛋白(Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA)的m RNA及其蛋白表达水平变化;探讨氟中毒在肝纤维化发病中的作用,以及自噬在氟中毒所致肝纤维化中的作用。方法:(1)复制动物模型:将144只体重约为90 10.84g的SD大鼠适应性喂养一周后,据体质量采用随机数字表法分为12组,每组12只(雌雄各半)。动物分组情况如下:(1)氟中毒组(饲养6个月):对照组(control,C)、低氟组(low concentration fluoride,LF)、中氟组(medium concentration fluoride,MF)、高氟组(high concentration fluoride,HF);(2)自噬激动剂组(染氟6个月后,腹腔注射雷帕霉素,注射剂量为1mg/kg/d,注射为期1w):对照组+雷帕霉素(control+rapamycin,CR)、低氟组+雷帕霉素(low concentration fluoride+rapamycin,LFR)、中氟组+雷帕霉素(medium concentration fluoride+rapamycin,MFR)、高氟组+雷帕霉素(high concentration fluoride+rapamycin,HFR);(3)自噬抑制剂组(染氟6个月后,腹腔注射氯喹,注射剂量为50mg/kg/d,注射为期1w):对照组+氯喹(control+chloroquine,CC)、低氟组+氯喹(low concentration fluoride+chloroquine,LFC)、中氟组+氯喹(medium concentration fluoride+chloroquine,MFC)、高氟组+氯喹(high concentration fluoride+chloroquine,HFC)。(2)骨氟和尿氟含量测定:各组大鼠处死前24h用代谢笼收集尿液;处死大鼠后收集各组大鼠双侧前肢骨;骨氟及尿氟含量检测均使用氟离子选择电极法。(3)肝组织病理形态学观察:采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H&E)染色观察大鼠病理形态学改变。(4)肝组织胶原纤维沉积情况观察:采用Masson染色观察大鼠肝组织胶原纤维沉积情况并计算其胶原体积分数(collagen volume fraction,CVF),据Ishak评分系统来反映肝纤维化进展情况。(5)自噬及肝纤维化相关蛋白m RNA及其蛋白水平变化:分别采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,q PCR)及免疫组织化学法(Immunohistochemical,IHC)检测肝组织LC-3B、Beclin-1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和α-SMA m RNA及其蛋白的表达情况。结果:(1)建立氟中毒大鼠模型:随着染氟浓度增加,氟斑牙发病率明显上升;大鼠骨氟、尿氟[骨氟:(92.52 5.64、112.21 11.86、143.00 7.87、235.63 11.55)mg/kg;尿氟:(5.47 0.88、17.78 1.48、54.16 5.96、121.11 6.32)mg/L]含量显著升高(P<0.05),以上均提示成功建立氟中毒大鼠模型。(2)大鼠肝组织病理形态学改变:对照组肝小叶结构清晰,肝板沿着中央静脉呈辐射状排列整齐,但随着染氟浓度增加肝细胞水肿程度加重;在相同的染氟浓度组,给予雷帕霉素后肝细胞形态未见明显改变,但给予氯喹后肝细胞水肿程度加重。(3)肝组织胶原纤维沉积情况:对照组中央静脉无胶原纤维沉积,但随着染氟的浓度增加,肝组织CVF(0.00 0.00、0.03 0.01、0.05 0.01、0.10 0.02)%及Ishak评分(0.00 0.00、1.08 0.73、2.35 0.76、4.10 0.87)升高(P<0.05);给予雷帕霉素后,肝组织CVF(0.00 0.00、0.03 0.01、0.09 0.01、0.13 0.02)%及Ishak评分(0.04 0.19、1.43 1.06、3.13 1.07、5.03 0.80)升高(P<0.05);给予氯喹后,肝组织CVF(0.00 0.00、0.01 0.00、0.02 0.01、0.04 0.01)%及Ishak评分(0.00 0.00、0.70 0.64、2.83 1.16、3.33 1.25)降低(P<0.05)。(4)自噬及肝纤维化相关蛋白m RNA表达量变化:经氟处理后SD大鼠肝组织LC-3B(0.95 0.06、1.17 0.08、1.39 0.07、1.36 0.17)、Beclin-1(0.96 0.07、1.27 0.04、1.97 0.32、3.02 0.10)、Col-Ⅰ(0.95 0.04、1.10 0.01、1.50 0.08、1.66 0.05)、Col-Ⅲ(0.49 0.05、1.15 0.02、1.18 0.06、1.75 0.15)及α-SMA(1.00 0.01、1.15 0.13、2.11 0.10、2.63 0.04)m RNA表达量增加(P<0.05);给予雷帕霉素后,肝组织LC-3B(1.09 0.01、1.72 0.06、2.04 0.05、2.54 0.17)、Beclin-1(1.15 0.05、1.96 0.19、2.82 0.16、3.46 0.23)、Col-Ⅰ(0.94 0.06、1.20 0.03、2.04 0.04、2.83 0.10)、Col-Ⅲ(1.05 0.05、1.49 0.20、2.30 0.11、3.69 0.28)及α-SMA(1.24 0.04、1.58 0.09、2.79 0.16、2.75 0.08)m RNA表达量增加(P<0.05);给予氯喹后,肝组织LC-3B(0.84 0.06、1.23 0.10、1.31 0.12、1.82 0.05)、Beclin-1(0.62 0.08、1.10 0.09、2.15 0.10、3.20 0.06)、Col-Ⅰ(0.51 0.05、0.76 0.06、1.21 0.11、1.27 0.07)、Col-Ⅲ(0.77 0.05、1.18 0.10、2.13 0.04、2.27 0.06)及α-SMA(0.59 0.03、1.03 0.02、1.87 0.13、2.11 0.02)m RNA表达量较氟中毒组增加(P<0.05),但明显低于自噬激动剂组(P<0.05)。(5)自噬及肝纤维化相关蛋白表达量变化:经氟处理后SD大鼠肝组织LC-3B(0.00 0.00、0.03 0.01、0.06 0.01、0.12 0.02)、Beclin-1(0.03 0.01、0.05 0.01、0.08 0.01、0.12 0.04)、Col-Ⅰ(0.00 0.00、0.03 0.00、0.08 0.01、0.13 0.01)、Col-Ⅲ(0.00 0.00、0.01 0.00、0.02 0.00、0.04 0.01)及α-SMA(0.00 0.00、0.00 0.00、0.00 0.00、0.01 0.00)蛋白表达量增加(P<0.05);给予雷帕霉素后,肝组织LC-3B(0.03 0.01、0.07 0.01、0.11 0.01、0.17 0.01)、Beclin-1(0.07 0.01、0.11 0.15、0.13 0.02、0.22 0.02)、Col-Ⅰ(0.08 0.01、0.12 0.02、0.15 0.02、0.21 0.02)、Col-Ⅲ(0.04 0.01、0.11 0.02、0.22 0.02、0.26 0.02)及α-SMA(0.01 0.00、0.01 0.00、0.02 0.00、0.02 0.00)蛋白表达量增加(P<0.05);给予氯喹后,肝组织LC-3B(0.02 0.01、0.05 0.01、0.07 0.01、0.13 0.01)、Beclin-1(0.03 0.01、0.07 0.01、0.11 0.01、0.16 0.02)、Col-Ⅰ(0.06 0.01、0.09 0.01、0.12 0.02、0.15 0.02)、Col-Ⅲ(0.10 0.01、0.14 0.01、0.17 0.02、0.21 0.01)及α-SMA(0.00 0.00、0.01 0.00、0.01 0.00、0.01 0.00)蛋白表达量较氟中毒组增加(P<0.05),但明显低于自噬激动剂组(P<0.05)。结论:(1)长期摄入过量氟引起的肝细胞自噬水平增加,而致大鼠肝纤维化的形成,可能是氟中毒引起肝组织的损伤机制之一。(2)雷帕霉素通过激动氟中毒大鼠肝细胞的自噬水平进一步加重氟中毒诱导的肝纤维化,而氯喹则通过抑制氟中毒大鼠肝细胞的自噬水平相对改善氟中毒诱导的肝纤维化。