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化学氮肥的生产和应用满足了农业生态系统对活性氮的需求，为不断增长的人口提供了食物。然而，随着化学氮肥生产和施用量的增加，氮肥利用率越来越低，气态和溶解态的氮流失导致了水和空气污染的增加、大气温室气体浓度的升高和生物多样性的丧失等一系列环境问题，对化学氮肥的过度依赖不利于农业的可持续发展。生物固氮是固氮微生物在固氮酶的催化下将空气中的氮气转化为活性氮的自然过程，是农业生产中活性氮的主要非人为输入来源，更有效地开发和利用生物固氮作用是逐步降低氮肥施用量的潜在途径。开展固氮菌资源的收集及特性研究对于实现固氮菌资源有效利用、提高土壤生物固氮能力具有重要的现实意义。
本研究选用4种具有不同固氮能力的水稻土，采用稀释平板法和富集纯化法从土壤中分离可培养固氮菌株。通过无氮培养基中的生长状况、基因组DNA的nifH基因扩增和固氮能力的定量测定筛选优势固氮菌株。通过培养特性和接种效果初步研究优势固氮菌株的促生潜力。采用16S rRNA基因比对与系统发育分析、全基因组测序与相关指数比较、形态与生理生化特征分析及化学特征分析对优势固氮菌株进行物种（亚种）水平的多相分类研究。
在光照培养条件下，采用BG11-N无氮培养基共分离纯化得到自养菌株7株，细胞呈圆形或椭圆形、单列、无分枝、丝状和念珠状，在固体培养基上形成团垫状菌落。新分离菌株在无氮培养基中生长状况良好，以基因组DNA为模板可扩增出nifH基因，乙炔还原法和15N2示踪法测定结果显示具有较高固氮能力，同时具有铁载体生成能力。结合16S rRNA基因序列比对和形态特征，7株菌株可初步鉴定属于念珠藻科（Nostocaceae）。
采用Brown无氮培养基共分离纯化得到异养菌株14株。结合16S rRNA基因序列比对和系统发育信息，新分离菌株分别可归类为:假节杆菌属（Pseudarthrobacter）1株、芽孢杆菌属(Bacillus)3株、固氮菌属（Azotobacter）4株、节杆菌属(Arthrobacter)2株、农杆菌属（Agrobacterium）1株、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）2株、根瘤菌属(Rhizobium)1株。
新分离菌株P204、P205、P207和P208在无氮培养基中生长速率较快，乙炔还原活性和固氮活性较高。除固氮能力外，新分离菌株P204、P205、P207和P208具有IAA生成、溶磷活性和铁载体生成等促进植物生长潜力的培养特性。特别是菌株P208，固氮活性为模式菌株Azotobacter chroococcum ATCC9043T的2.61倍，IAA生成能力为Azotobacter chroococcum ATCC9043T的1.48倍，铁载体活性单位高达88.21％，室内培养条件下接种菌株P208能够促进水稻、小麦幼苗根系的生长。
基于16S rRNA基因和基因组92个核心基因的系统发育分析结果表明，新分离菌株P204、P205、P207、P208与Azotobacter chroococcum IAM12666T(=ATCC9043T)的遗传发育距离最近（16S rRNA基因相似度为99.00～99.79％）。同时，4株菌株与Azotobacter chroococcum ATCC9043T的平均核苷酸一致性(ANI)、平均氨基酸一致性(AAI)和数字DNA-DNA杂交值(dDDH)接近或高于物种分类阈值(ANI＞95～96％，AAI＞95～96％，dDDH＞70％)，最大唯一匹配指数(MUMi)低于物种分类阈值(＜0.33)。结合形态与生理生化特征分析及化学特征分析，明确得出4株菌株为褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）。
新分离菌株P205在系统发育分析中具有不同于其他Azotobacter chroococcum菌株的独立分枝，与其他Azotobacter chroococcum菌株具有相对较低的平均核苷酸一致性(ANI)和平均氨基酸一致性(AAI)，与其他Azotobacter chroococcum菌株的数字DNA-DNA杂交值(dDDH)显著低于亚种分类阈值(＞79～80％)。同时，菌株P205与模式菌株Azotobacter chroococcum ATCC9043T的形态与生理生化特征、化学特征几乎一致，但LB培养基中的生长状况、部分碳源的利用和对万古霉素的化学敏感性不同。由此可明确，菌株P205代表了不同于模式菌株Azotobacter chroococcum ATCC9043T的Azotobacter chroococcum新亚种。因此，建议将Azotobacter chroococcum分为两个亚种，命名为Azotobacter chroococcum subsp.chroococcum和Azotobacter chroococcum subsp.isscasi,分别以ATCC9043和P205作为模式菌株。
测序分析了模式菌株Azotobacter chroococcum ATCC9043T和4株新分离Azotobacter chroococcum菌株的全基因组序列，为进一步研究Azotobacter chroococcum菌株的系统分类、功能基因、代谢途径和比较基因组学提供基础。
综上，本研究采用无氮培养基从水稻土中共分离纯化得到自养菌株7株和异养菌株14株，丰富了土壤微生物研究的试验材料和微生物菌种资源，其中菌株P204、P205、P207和P208具有较好的固氮促生应用潜力，特别是菌株P208，具有很好的开发应用前景，可用于进一步功能基因开发和微生物接种应用研究。根据多相分类研究结果，对Azotobacter chroococcum进行了描述修正，分类命名了Azotobacter chroococcum subsp.isscasi，建立描述了Azotobacter chroococcum subsp.chroococcum，完善了Azotobacter chroococcum的系统分类信息。
本研究选用4种具有不同固氮能力的水稻土，采用稀释平板法和富集纯化法从土壤中分离可培养固氮菌株。通过无氮培养基中的生长状况、基因组DNA的nifH基因扩增和固氮能力的定量测定筛选优势固氮菌株。通过培养特性和接种效果初步研究优势固氮菌株的促生潜力。采用16S rRNA基因比对与系统发育分析、全基因组测序与相关指数比较、形态与生理生化特征分析及化学特征分析对优势固氮菌株进行物种（亚种）水平的多相分类研究。
在光照培养条件下，采用BG11-N无氮培养基共分离纯化得到自养菌株7株，细胞呈圆形或椭圆形、单列、无分枝、丝状和念珠状，在固体培养基上形成团垫状菌落。新分离菌株在无氮培养基中生长状况良好，以基因组DNA为模板可扩增出nifH基因，乙炔还原法和15N2示踪法测定结果显示具有较高固氮能力，同时具有铁载体生成能力。结合16S rRNA基因序列比对和形态特征，7株菌株可初步鉴定属于念珠藻科（Nostocaceae）。
采用Brown无氮培养基共分离纯化得到异养菌株14株。结合16S rRNA基因序列比对和系统发育信息，新分离菌株分别可归类为:假节杆菌属（Pseudarthrobacter）1株、芽孢杆菌属(Bacillus)3株、固氮菌属（Azotobacter）4株、节杆菌属(Arthrobacter)2株、农杆菌属（Agrobacterium）1株、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）2株、根瘤菌属(Rhizobium)1株。
新分离菌株P204、P205、P207和P208在无氮培养基中生长速率较快，乙炔还原活性和固氮活性较高。除固氮能力外，新分离菌株P204、P205、P207和P208具有IAA生成、溶磷活性和铁载体生成等促进植物生长潜力的培养特性。特别是菌株P208，固氮活性为模式菌株Azotobacter chroococcum ATCC9043T的2.61倍，IAA生成能力为Azotobacter chroococcum ATCC9043T的1.48倍，铁载体活性单位高达88.21％，室内培养条件下接种菌株P208能够促进水稻、小麦幼苗根系的生长。
基于16S rRNA基因和基因组92个核心基因的系统发育分析结果表明，新分离菌株P204、P205、P207、P208与Azotobacter chroococcum IAM12666T(=ATCC9043T)的遗传发育距离最近（16S rRNA基因相似度为99.00～99.79％）。同时，4株菌株与Azotobacter chroococcum ATCC9043T的平均核苷酸一致性(ANI)、平均氨基酸一致性(AAI)和数字DNA-DNA杂交值(dDDH)接近或高于物种分类阈值(ANI＞95～96％，AAI＞95～96％，dDDH＞70％)，最大唯一匹配指数(MUMi)低于物种分类阈值(＜0.33)。结合形态与生理生化特征分析及化学特征分析，明确得出4株菌株为褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）。
新分离菌株P205在系统发育分析中具有不同于其他Azotobacter chroococcum菌株的独立分枝，与其他Azotobacter chroococcum菌株具有相对较低的平均核苷酸一致性(ANI)和平均氨基酸一致性(AAI)，与其他Azotobacter chroococcum菌株的数字DNA-DNA杂交值(dDDH)显著低于亚种分类阈值(＞79～80％)。同时，菌株P205与模式菌株Azotobacter chroococcum ATCC9043T的形态与生理生化特征、化学特征几乎一致，但LB培养基中的生长状况、部分碳源的利用和对万古霉素的化学敏感性不同。由此可明确，菌株P205代表了不同于模式菌株Azotobacter chroococcum ATCC9043T的Azotobacter chroococcum新亚种。因此，建议将Azotobacter chroococcum分为两个亚种，命名为Azotobacter chroococcum subsp.chroococcum和Azotobacter chroococcum subsp.isscasi,分别以ATCC9043和P205作为模式菌株。
测序分析了模式菌株Azotobacter chroococcum ATCC9043T和4株新分离Azotobacter chroococcum菌株的全基因组序列，为进一步研究Azotobacter chroococcum菌株的系统分类、功能基因、代谢途径和比较基因组学提供基础。
综上，本研究采用无氮培养基从水稻土中共分离纯化得到自养菌株7株和异养菌株14株，丰富了土壤微生物研究的试验材料和微生物菌种资源，其中菌株P204、P205、P207和P208具有较好的固氮促生应用潜力，特别是菌株P208，具有很好的开发应用前景，可用于进一步功能基因开发和微生物接种应用研究。根据多相分类研究结果，对Azotobacter chroococcum进行了描述修正，分类命名了Azotobacter chroococcum subsp.isscasi，建立描述了Azotobacter chroococcum subsp.chroococcum，完善了Azotobacter chroococcum的系统分类信息。