背景/目的苯并[a]芘（Benzoapyrene,BaP）是多环芳烃中的一种典型代表,广泛存在于汽车尾气、木炭的燃烧和化石燃料、香烟烟雾、烧烤食物以及各种污染的空气中,BaP是室内和室外空气中的重要颗粒物成分。BaP在自然环境中降解缓慢,人们通常以吸入和膳食摄入等方式受到不同程度的BaP暴露,呼吸道、消化道以及皮肤是BaP暴露的主要途径。在细胞内,BaP可被细胞色素P450酶系代谢活化,进入到机体中的BaP被代谢为7,8-二羟-9,10-环氧苯并[a]芘（benzoapyrene-7,8-diol-9,10-epoxide,BPDE）等多种毒性代谢产物,它们与DNA共价结合形成BaP-DNA加合物,造成DNA损伤和基因组不稳定,诱发活性氧的过量产生,引起核酸、脂质、蛋白质等大分子发生氧化损伤和细胞的氧化应激反应。目前普遍认定BPDE是BaP在人体内的最终致癌物。一直以来,BaP的诱癌和致癌作用备受关注。越来越多的研究发现,BaP具有肝脏毒性、肾脏毒性、神经毒性等多器官毒性。肺也是BaP的一个直接靶器官,越来越多的研究表明短期或急性BaP暴露可以引起除肺癌之外的其他的呼吸系统疾病。急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）是一种严重的肺部急性炎症,是由各种直接或间接因素导致的弥漫性肺实质损害,是以肺中性粒细胞蓄积、肺间质水肿、肺泡上皮损伤为特征的综合征。目前的研究表明,急性肺损伤时常伴有肺部炎症反应。肺间质纤维化（Interstitial pulmonary fibrosis,IPF）是一种进行性的间质性肺病,发病原因不明、发病机制不清。肺间质纤维化是机体对不同病因所致间质性肺病损伤的过度修复反应,其早期病理学特征主要表现为弥漫性肺泡炎症、肺泡结构紊乱,晚期主要变现为成纤维细胞增生,细胞外基质异常积聚和胶原含量增加,临床上肺间质纤维化的病人常表现为呼吸困难和和不可逆性肺功能损害,最终导致呼吸衰竭和死亡。目前的证据表明上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）在肺间质纤维化的发生发展过程中发挥着重要的作用。一些实验室证据和流行病学研究均提示,BaP急性或短期暴露可能引起急性肺损伤和肺间质纤维化,但是缺少直接相关的实验室证据。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）是谷胱甘肽的前体,是一种已知的抗氧化剂,具有抗氧化和抗炎的生物学功能。之前的研究已经表明,NAC对急性肺损伤和肺间质纤维化具有一定的治疗效果。但是,BaP急性或短期暴露是否可以引起急性肺损伤和肺间质纤维化还不清楚,NAC补充是否可以减轻BaP暴露所致急性肺损伤和肺间质纤维化也需要进一步的证明。本研究的主要目的是为了研究急性BaP暴露对小鼠急性肺损伤和肺部炎症的影响、以及慢性BaP暴露对小鼠肺间质纤维化和EMT的影响,并探讨了NAC补充对于BaP暴露引起的小鼠急性肺损伤和肺间质纤维化的调控作用以及可能的机制。方法（1）急性BaP暴露对小鼠急性肺损伤和肺部炎症的影响为了评价急性BaP暴露对小鼠急性肺损伤和肺部炎症的影响,选择C57BL/6J雄性小鼠48只,将所有C57BL/6J雄性小鼠均匀分成了对照（Ctrl）组和BaP暴露组,BaP组小鼠给予单次气管滴注BaP（2 mg/m L）,滴注剂量为45μL/只小鼠,Ctrl组小鼠给予单纯的溶剂对照（二甲基亚砜,DMSO）气管滴注,两组之间滴注体积保持一致。分别在BaP单次暴露6 h、24 h和48 h后乙醚雾化麻醉小鼠,部分小鼠收集肺泡细胞灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）;部分小鼠眼眦取血,收集小鼠肺组织。通过苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining）染色观察小鼠肺组织病理学结构和形态学改变情况,通过蛋白免疫印迹,逆转录PCR和免疫组织化学等方法检测小鼠肺组织炎性因子水平以及炎性信号通路激活情况。（2）NAC预处理对急性BaP暴露所致小鼠急性肺损伤和肺部炎症的影响为了观察NAC预处理对急性BaP暴露所致小鼠急性肺损伤和肺部炎症的影响,将32只C57BL/6J雄性小鼠均匀分成了四组,分别为对照（Ctrl）组,NAC预处理（NAC）组,模型（BaP）组,NAC预处理加模型（NAC+BaP）组。给予BaP组和NAC+BaP组小鼠单次气管滴注BaP（2 mg/m L）,滴注剂量为45μL/只小鼠,Ctrl和NAC组小鼠给予气管滴注DMSO。NAC组和NAC+BaP组小鼠在BaP暴露前8 h和暴露后8 h,通过腹腔注射各补充一次NAC（1g/kg）,Ctrl和BaP组小鼠给予腹腔注射生理盐水。BaP暴露后8 h处死小鼠,收集血清和小鼠肺组织。通过HE染色观察小鼠肺组织病理学结构和形态学改变情况,通过蛋白免疫印迹和免疫组织化学的方法检测小鼠肺NF-κB信号的激活情况。（3）NAC预处理对BaP暴露激活肺泡上皮细胞NF-κB信号的调控作用为了观察NAC预处理对BaP暴露激活人肺泡上皮细胞NF-κB信号的调控作用,将人肺癌肺泡基底上皮细胞（A549）细胞随机分成对照组（Ctrl）,NAC预处理组（NAC）,BaP共培养组（BaP）,NAC预处理+BaP共培养组（NAC+BaP）。在BaP组和NAC+BaP组中,A549细胞给予BaP（0.1m M）进行共培养,Ctrl组和NAC组A549细胞给予0.1%的DMSO共培养,NAC组和NAC+BaP组细胞在BaP暴露前2 h和12 h,两次添加NAC（4 m M）进行共培养,BaP暴露24 h后收集细胞,通过蛋白免疫印迹的方法检测A549细胞中NF-κB信号激活情况,通过逆转录PCR的方法检测A549细胞中促炎因子和趋化因子m RNA水平。（4）慢性BaP暴露对小鼠肺间质纤维化和EMT的影响为了观察慢性BaP暴露对小鼠肺损伤和肺间质纤维化的影响,将40只C57BL/6J雄性小鼠均匀分成了Ctrl和BaP组,BaP组连续6周气管滴注BaP（25μg/次/周）,Ctrl组滴注相同体积DMSO,6周以后处死半数小鼠,收集小鼠肺组织,称量小鼠肺重和体重,通过HE染色评价小鼠肺损伤情况,通过胶原染色检测小鼠肺胶原沉积情况,通过蛋白免疫印迹和免疫组织化学的方法检测小鼠肺EMT以及胶原沉积相关指标蛋白表达水平;剩余半数小鼠通过肺功能仪检测小鼠肺功能水平。（5）慢性BaP暴露对人肺泡上皮细胞EMT的影响为了观察慢性BaP暴露对正常人肺泡上皮细胞（BEAS-2B）EMT的影响,将BEAS-2B细胞与BaP（0.1 m M）进行共培养,培养2周以后,通过免疫荧光（Immunofluorescence,IF）的方法检测BEAS-2B细胞的EMT核转录因子核转位情况。（6）NAC补充对慢性BaP暴露所致小鼠肺间质纤维化和肺泡上皮细胞EMT的影响为了观察NAC预处理对慢性BaP暴露所致小鼠肺间质纤维化的影响,将60只C57BL/6J雄性小鼠均匀分成了四组,分别为对照（Ctrl）组,NAC预处理（NAC）组,模型（BaP）组,NAC预处理加模型（NAC+BaP）组。BaP组和NAC+BaP组小鼠连续6周气管滴注BaP,滴注剂量为25μg/次/周,NAC组和NAC+BaP组小鼠每天通过腹腔注射各补充一次NAC（1g/kg）,6周以后处死小鼠,收集小鼠血清和肺组织,通过马松染色检测小鼠肺胶原纤维沉积。为了观察NAC预处理对慢性BaP暴露所致人肺泡上皮细胞EMT的影响,将BEAS-2B细胞随机分成对照组（Ctrl）,NAC预处理组（NAC）,BaP共培养组（BaP）,NAC预处理+BaP共培养组（NAC+BaP）。在BaP组和NAC+BaP组,将BEAS-2B细胞给予BaP（0.1 m M）进行共培养,Ctrl组和NAC组BEAS-2B细胞给予0.1%的DMSO共培养,NAC组和NAC+BaP组细胞添加NAC（4 m M）进行共培养2周,通过免疫荧光的方法检测BEAS-2B细胞EMT核转录因子和EMT标志蛋白的水平。结果（1）急性BaP暴露诱发小鼠急性肺损伤和肺部炎症急性BaP暴露升高了小鼠绝对肺重和相对肺系数;肺组织HE染色表明:急性BaP暴露引起了小鼠肺组织损伤、肺泡腔坍塌、明显的炎性细胞浸润以及气道壁增厚和气道腔狭窄。检测小鼠肺部炎性因子和炎症信号通路发现:急性BaP暴露升高了小鼠BALF中炎性细胞数,上调了小鼠肺促炎因子和趋化因子m RNA水平;急性BaP暴露上调了小鼠肺MAPK p38、MAPK JNK和MAPK ERK1/2蛋白磷酸化水平;急性BaP暴露促进了小鼠肺NF-κB p65和p50核转位、增加了IκBα的磷酸化水平。（2）NAC预处理减轻急性BaP暴露所致小鼠急性肺损伤和肺部炎症NAC补充减轻了BaP暴露上调小鼠肺重和肺系数,减轻了BaP暴露所致肺部炎性细胞浸润和肺泡间隔损伤,抑制了BaP暴露引起的气道壁增厚和气道腔面积狭窄。检测小鼠肺部炎性因子和炎症信号通路发现:NAC补充抑制了急性BaP暴露所致的小鼠肺NF-κB p65和IκBα的磷酸化,NAC补充下调了急性BaP暴露引起的小鼠肺NF-κB p65和p50的核转位。（3）NAC预处理减轻BaP暴露激活肺泡上皮细胞NF-κB信号BaP共培养增加了A549细胞NF-κB p65和IκBα的磷酸化水平;此外,BaP共培养升高了BaP暴露引起A549细胞促炎因子和趋化因子m RNA水平的升高。有趣的是,NAC补充下调了BaP暴露引起的A549细胞NF-κB p65和IκBα的磷酸化;此外,NAC补充有效地抑制了BaP暴露引起A549细胞促炎因子和趋化因子m RNA水平的升高。（4）慢性BaP暴露诱发小鼠肺间质纤维化和EMT的影响慢性BaP暴露升高了小鼠肺重和肺系数,引起了小鼠肺损伤,增加了小鼠肺炎性细胞浸润。检测小鼠肺胶原沉积发现:慢性BaP暴露增加了小鼠肺胶原沉积、引起了肺羟脯氨酸水平升高,Collagen和α-SMA阳性细胞数在慢性BaP暴露的小鼠肺中也是明显增多的;此外,慢性BaP暴露损伤了小鼠肺功能。检测小鼠肺EMT相关指标发现:慢性BaP暴露降低了小鼠肺上皮标志（E-cadherin）蛋白表达、升高了间质蛋白（Vimentin）表达水平。此外,慢性BaP暴露上调了小鼠血清TGF-β水平、以及肺Smad2和Smad3的磷酸化水平。（5）慢性BaP暴露诱发人肺泡上皮细胞EMT慢性BaP暴露促进了BEAS-2B细胞EMT核转录因子（Snail和ZEB）核转位水平,促进了BEAS-2B细胞EMT进程。（6）NAC补充减轻慢性BaP暴露所致小鼠肺间质纤维化和肺泡上皮细胞EMT体内动物实验的结果表明:慢性BaP暴露显著增加了小鼠肺胶原纤维沉积,而NAC补充有效地抑制了慢性BaP暴露所致的小鼠肺胶原纤维沉积。体外细胞实验的结果表明:BaP共培养两周后,显著升高了BEAS-2B细胞α-SMA和Vimentin阳性细胞数、促进了EMT核转录因子Twist的核转位水平;而NAC共培养可以显著抑制慢性BaP暴露所致的BEAS-2B细胞α-SMA和Vimentin阳性细胞数增多、下调了慢性BaP暴露诱发的BEAS-2B细胞Twist核转位。结论急性BaP暴露诱发了小鼠急性肺损伤和肺部炎症反应、激活了小鼠肺NF-κB和MAPKs信号通路,NAC预处理可能通过抑制NF-κB信号通路激活减轻了急性BaP暴露所致小鼠急性肺损伤和肺部炎症反应。慢性BaP暴露引起了小鼠肺间质纤维化和肺泡上皮细胞EMT,NAC补充可以抑制慢性BaP暴露引起的小鼠肺间质纤维化和肺泡上皮细胞EMT进程。因此,以上结果提示NAC可以被用来作为空气污染物引起的肺部疾病的一个潜在的预防以及治疗药物。