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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是一种由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的,主要以腹泻、呕吐和脱水为特征,伴有厌食和体重减弱等症状的急性猪肠道传染性病毒病,自流行以来已给全世界养猪产业带来巨大的经济损失。除了生物防控外,疫苗免疫接种是当前防控PEDV感染的主要手段。目前市场上针对该病的疫苗多为灭活苗和弱毒苗,但这些疫苗无法产生足够的黏膜免疫,导致保护效果不理想,同时对目前流行毒株的保护力也不足,因此无法有效地控制该病的区域性流行。针对现有疫苗的不足,研发一种能加强现有疫苗黏膜免疫效果的佐剂,配合现有疫苗使用,以提高现有疫苗整体的免疫效力,这对于防控我国PED疫情具有重要意义。研究已证实霍乱毒素B亚基蛋白(Cholera Toxin B subunit,CTB)能够有效地提升免疫效果,是一种理想的候选黏膜免疫佐剂。本研究以CTB蛋白为研究对象,探索了该蛋白在原核表达系统pET-32a中的表达和纯化,并将纯化后的CTB蛋白与PEDV灭活疫苗联合使用,在小鼠动物模型上评估了联合使用的免疫方式及免疫效果,主要研究内容如下:1.CTB蛋白的原核表达、纯化本研究参考GenBank上霍乱毒素基因序列,获得编码的CTB蛋白的基因序列,合成后插入原核表达载体pET-32a中,成功构建了重组质粒pET-32a-CTB,并进一步获得了表达菌。表达菌经IPTG诱导表达后,对表达产物进行了SDS-PAGE和Western-blot分析和鉴定,结果表明目的蛋白大小约为30 kDa,并且以包涵体形式存在。将包涵体进行变性、纯化和复性的处理,最终获得了纯化且可溶的CTB蛋白。2.CTB蛋白联合PEDV灭活疫苗皮下注射免疫效果的评估将CTB蛋白与铝胶等体积预混,再与灭活PEDV进行混合制备成灭活疫苗,按照100μL/每只的剂量皮下注射免疫6周龄SPF BALB/c小鼠,共分为4组:灭活PEDV+铝胶+CTB组、灭活PEDV+铝胶组、CTB组和PBS对照组,免疫2次,间隔1周。于第4周至第9周每周随机挑选三只小鼠采血检测血清中IgG抗体水平及中和抗体水平,第7周至第9周随机挑选三只小鼠采集肠组织检测IgA抗体水平及中和抗体水平。CTB蛋白联合PEDV灭活疫苗通过皮下注射免疫小鼠。检测血清IgG抗体水平及血清中和抗体效价(49 d)的结果表明,CTB蛋白能够有效提升小鼠血清PEDV特异性IgG抗体水平,与其他组相比表现出极显著差异(P<0.01),同时血清中和抗体水平为1:113.3,也显著高于其他组(P<0.05),小鼠肠组织IgA抗体的检测结果表明各组肠组织IgA水平差异不大。3.CTB蛋白联合PEDV灭活疫苗口服免疫效果的探索PEDV是以肠道黏膜入侵为主的病毒,因此我们不但需要能够诱导怀孕母猪产生一定的全身性免疫,同时还需要能诱导其产生足够的黏膜免疫使新生仔猪获得母源sIgA抗体,因此本研究探索了CTB蛋白联合PEDV灭活疫苗口服免疫的可能性。将CTB蛋白与0.4%壳聚糖等体积预混,再与灭活PEDV进行混合制备成口服灭活疫苗,按照100μL/每只的剂量口服免疫6周龄SPF BALB/c小鼠,共分为4组:灭活PEDV+0.4%壳聚糖+CTB组、灭活PEDV+0.4%壳聚糖组、0.4%壳聚糖组和PBS对照组,免疫程序及检测指标与上述皮下注射相同。口服免疫小鼠后,经血清IgG抗体水平及肠组织IgA抗体水平检测分析表明,CTB蛋白能够有效提升小鼠血清PEDV特异性IgG抗体水平,与其他组相比在49 d表现出极显著差异(P<0.01),同时49 d血清中和抗体水平为1:56.18,显著高于其他组(P<0.05)。小鼠肠组织IgA抗体在49 d及56 d时与其他组对比差异极显著(P<0.01),并且肠组织中和抗体水平为1:33.6,相比对照组也表现极显著差异(P<0.01)。以上结果表明CTB蛋白与灭活PEDV联合口服免疫时,能够刺激小鼠产生局部黏膜免疫和全身免疫。本研究探索了黏膜免疫佐剂CTB蛋白,与PEDV灭活疫苗联合使用,通过皮下免疫及口服免疫的方式提升了小鼠血清IgG抗体和小鼠肠道IgA抗体,有效地增强抗原的全身及局部黏膜反应,从而提升了PEDV灭活疫苗的免疫效果。