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背景:皮层扩散性抑制(Cortical spreading depression,CSD),基于其与梗死周围去极化波(peri-infarct depolarization,PID)的相似性,已经成为研究缺血半暗带向梗死中心区演变机制的良好实验模型。很多研究都已证实,预先诱导CSD波可增加脑组织对抗缺血性损伤的耐受性,但是其潜在的病理生理机制仍不清楚。近年来,很多研究都已证明,自噬在脑缺血性损伤及脑对缺血耐受方面起重要作用。自噬在缺血/再灌注损伤中的作用成为脑保护研究领域的热点,其中AMPK-m TOR-自噬通路研究较为广泛。然而,其明确的作用在各种研究中结果不尽相同,且机制尚不明确,仍需要进一步探讨。以往关于CSD预处理机制方面的研究多集中在能量代谢、一氧化氮、神经生长因子、外生基因表达等方面,尚缺乏CSD预处理和自噬在缺血耐受方面相关性的研究。本实验应用大鼠大脑中动脉阻塞模型(Middle cerebral artery occlusion,MCAO),探讨CSD预处理的病理生理机制,进一步明确自噬在缺血再灌注损伤中神经保护作用机制及AMPK-m TOR-自噬通路在缺血耐受中的作用,为缺血性脑血管病的治疗和预防提供新靶点。目的:通过研究CSD预处理,进一步探讨缺血半暗带向梗死中心区演变的机制。同时也首次将CSD预处理与自噬及其相关通路、自噬在缺血耐受中的作用联系起来,并进一步明确自噬在缺血再灌注损伤中的作用及机制。方法:(1)皮层给1 mol/L氯化钾溶液湿敷2小时诱导皮层扩散性抑制波(CSD),通过脑电图监测及电生理记录直流场电位(direct current potential,DC)变化的方法证实CSD波的发生及其特征,建立CSD预处理的实验模型,对照组用1 mol/L的氯化钠溶液湿敷2小时。(2)CSD预处理与AMPK-m TOR-自噬相关通路研究。112只雄性Wistar大鼠随机分组:盐水对照组;预处理组(0、3、6、12、24小时)组;3-MA(i.c.v.)+CSD组;溶剂对照(i.c.v.)+CSD组;Compound C(i.p)+CSD组;溶剂对照(i.p)+CSD组。盐水对照组皮层给予1 mol/L氯化钠溶液湿敷2小时,12小时后取材;预处理组皮层给予1 mol/L氯化钾溶液湿敷2小时,分别在0、3、6、12、24小时后取材;各给药组在CSD预处理术前30 min分别给予自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA,200 nmol,i.c.v.)和AMPK抑制剂Compound C(CC,20 mg/kg,i.p)。Western blotting检测各组皮层自噬标记物LC3-II,Beclin-1,P62水平,AMPK-m TOR通路蛋白p-AMPK(Thr172)/AMPK,p-P70S6K(Thr389)、ULK1水平;免疫荧光检测LC3-II阳性细胞数及分布,透射电镜检测自噬小体水平。(3)CSD预处理在缺血再灌注损伤中的神经保护作用。84只雄性Wistar大鼠随机分组:盐水对照组,CSD预处理(0、3、6、12、24小时)组,3-MA组,溶剂对照组。盐水对照组:盐水预处理后12小时,行MCAO缺血2小时,再灌注12小时;CSD预处理组:分别在CSD预处理后0,3,6,12,24小时后分别行MCAO缺血2小时,再灌注12小时;3-MA组:CSD预处理前30分钟给予自噬抑制剂3-MA(200 nmol,i.c.v.),预处理后12小时后行MCAO缺血2小时,再灌注12小时;溶剂对照组:CSD预处理前30分钟给予相同体积的溶剂(i.c.v.),预处理后12小时后后行MCAO缺血2小时,再灌注12小时。应用TTC染色法计算各组梗死体积,Longa法评估神经功能缺损,并进行相关统计学分析。(4)自噬在缺血再灌注损伤中神经保护作用的机制初步探讨。30只雄性Wistar大鼠随机分5组:假手术组(Sham),MCAO组,CSD+MCAO组,3-MA+CSD+MCAO组,溶剂+CSD+MCAO组。通过reverse transcriptase-PCR、Western blotting检测MCAO缺血再灌注损伤后半暗带区皮层凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase12,内质网应激相关蛋白GRP78、XBP1,缝隙连接蛋白Connexin 36的m RNA水平及蛋白水平;TUNEL及免疫荧光双标染色显示凋亡细胞的比例及细胞类型。结果:(1)皮层给予1 mol/L氯化钾溶液可引起诱导侧皮层脑电图波幅的持续性下降,由117.25±3.51μV下降到78.36±3.46μV(P<0.01),而频率和波形没有明显改变,脑电活动被抑制;电生理学改变为直流场电位的负翻转,证明CSD预处理模型建立成功,而对照组没有相应脑电图及电生理改变。(2)CSD预处理对自噬及AMPK-m TOR通路的影响:Western blotting示,CSD可增加大鼠预处理侧皮层LC3-II,Beclin-1水平及p-AMPK(Thr172)/AMPK比率,减少P62和p-P70S6K(Thr389)水平,这种改变在预处理后12小时达到高峰;应用AMPK抑制剂Compound C(20 mg/kg)可下调皮层LC3-II,p-AMPK(Thr172)/AMPK比率,上调P62和p-P70S6K(Thr389)水平。免疫荧光显示,LC3-II阳性细胞数在预处理组明显高于对照组(P<0.01),且主要分布于神经元细胞中(87.2%),神经胶质细胞中较少(2.89%);应用3-MA(P<0.01)及CC(P<0.05)后,LC3-II阳性细胞数减少。透射电镜显示预处理组皮层自噬小体的数量明显高于对照组(P<0.05)。(3)CSD预处理可显著降低大鼠MCAO后的脑梗死体积,改善功能学评分,且这种保护作用在预处理后12小时达到高峰(P<0.05);应用自噬的抑制剂3-MA(200 nmol,i.c.v.)可减少CSD预处理对梗死体积及神经功能评分的影响(P<0.05)。(4)CSD预处理可减少缺血再灌注损伤的半暗带区皮层内凋亡相关标记物Caspase12蛋白质水平和m RNA水平,增加抗凋亡标记物Bcl-2蛋白和m RNA水平,TUNEL染色显示CSD预处理明显减少半暗带区神经元细胞凋亡的比例(P<0.01);CSD可降低内质网应激标记物GRP78的蛋白质水平和m RNA水平,减少XBP-1蛋白水平,增加其m RNA水平。应用自噬抑制剂3-MA后可逆转上述改变。CSD预处理后神经元表面主要缝隙连接蛋白Connexin 36的蛋白质和m RNA水平无明显改变(P>0.05)。结论:(1)皮层持续给予1 mol/L氯化钾溶液2小时可引起预处理侧皮层脑电活动的抑制,脑电图波幅降低,诱导负性直流DC波的产生,成功建立CSD预处理模型;而给予1 mol/L氯化钠溶液未引起上述改变。(2)CSD可通过AMPK-m TOR通路诱导自噬激活,且激活的自噬主要分布在神经元细胞中,胶质细胞中少见。(3)CSD预处理具有明确的神经保护作用,减少梗死体积,改善神经功能评分,且在预处理后12小时达高峰。(4)CSD预处理诱导的自噬可减少大鼠缺血再灌注损伤半暗带区皮层的神经元凋亡,抑制内质网应激的过度激活,从而产生神经保护作用,而对神经元表面主要缝隙连接蛋白Connexin 36没有影响。