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目的:研究葛根素对MC3T3-E1成骨细胞发育的影响及机制,为临床治疗骨质疏松症及葛根素的开发利用提供一定的理论指导。方法:1.细胞活性测定:不同浓度的(0.1,1,l0μM)葛根素培养成骨细胞24,48和72h后,CCK-8法检测空白对照组和葛根素组的细胞活性。2.细胞分化水平测定:lμM葛根素作用于成骨细胞72h后测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性。3.细胞矿化水平测定:lμM葛根素处理成骨细胞7、14和21d后,茜素红钙结节染色法测定细胞矿化结节面积。4.蛋白表达水平测定:1μM葛根素作用细胞0,48,72h后以及100μM RAP(自噬激动剂)和75μM 3-MA(自噬抑制剂)作用细胞72h后,Western Blotting法测定Beclin1和LC3B蛋白质的表达水平。5.细胞超微结构观察:1μM葛根素和100μM 3-MA作用成骨细胞72h后电镜下观察细胞超微结构并拍摄图片。6.自噬对成骨细胞的影响:使用100μM 3-MA作用MC3T3-E1细胞后,检测成骨细胞增殖、分化和矿化能力的改变。7.葛根素对miR-204表达水平的影响:RT-qPCR法检测葛根素作用后miR-204表达水平。8.miR-204的作用靶点预测:采用TargetScan靶点预测软件分析miR-204与小鼠LC3B基因可能的结合位点。9.miR-204对成骨细胞自噬水平和超微结构的影响:成骨细胞转染miR-204-siRNA后,检测LC3B蛋白质的表达水平并于电镜下观察细胞超微结构。结果:1.葛根素(0.1,1,10μM)可显著促进小鼠MC3T3-E1成骨细胞的增殖,1μμM葛根素为最佳浓度。与空白对照组相比,1μM的葛根素作用72h可明显提高ALP活性,并促进矿化结节的形成。2.1μM浓度葛根素作用于细胞后,与空白对照组比较自噬标志物Be clinl和LC3B的蛋白质表达水平明显升高,其中72h作用效果最好,且作用72h后葛根素组LC3B的蛋白表达水平略高于自噬激动剂组。此外,葛根素组细胞电镜下可明显观察到自噬特有的双层膜结构。3.自噬抑制剂(3-MA)作用细胞72h后,明显抑制成骨细胞增殖和分化,而对矿化结节形成影响不显著。4.1μM葛根素作用细胞72h后,miR-204表达水平显著下调。5.生物信息学分析表明,LC3B mRNA中的miR-204结合位点是位于LC3B 3’UTR的44和50bp之间的广泛保守的元件。6.转染miR-204-siRNA作用细胞后,与空白对照组比较,LC3B的蛋白质表达水平明显上升,并且电镜下细胞出现自噬特有的双层膜结构。结论:(1)葛根素可以促进成骨细胞增殖、分化和矿化。(2)葛根素作用于成骨细胞可以产生自噬现象。(3)葛根素作用成骨细胞产生的自噬可以促进成骨细胞增殖和分化,对矿化影响不明显。(4)下调miR-204表达导致LC3B表达增强可能是葛根素促成骨细胞自噬的分子机制。