现代化集约型养殖系统中,为了维持高产奶量,通常饲喂给泌乳奶牛大量谷物或易发酵日粮以提供充分的能量。有研究报道饲喂高精料日粮会引起反刍动物亚急性瘤胃酸中毒(Subacute ruminal acidosis,SARA)。之前的研究主要集中于高精料日粮对奶牛瘤胃上皮细胞结构和功能的影响。与具有复杂结构的瘤胃上皮相比,仅由单层结构组成的大肠更易“漏”。迄今为止,高精料饲喂对反刍动物后段肠道的影响研究甚少。本研究使用泌乳期奶山羊为模型,探索长期饲喂高精料日粮对后段肠腔发酵、微生物区系、代谢产物和肠道上皮细胞屏障功能的影响。此外,以肠道杯状细胞为模型,研究SARA时肠腔内的异常代谢产物群体感应(Quorum Sensing,QS)信号分子C12-HSL对细胞状态和黏液分泌功能的影响及其机制,为预防和治疗SARA提供新思路。1高精料日粮对后段肠道微生物区系和代谢的影响本研究使用微生物测序和代谢组学方法研究长期或短期饲喂高精料日粮对关中奶山羊后段肠道细菌群落的影响,并对它们的代谢产物进行研究。与对照组(日粮精粗比为35:65,饲喂19周)相比,长期(日粮精粗比为65:35,饲喂19周)和短期(日粮精粗比为65:35,饲喂4周)高精料组山羊后段肠道内容物中的游离内毒素(Lipopolysaccharide,LPS)浓度均显著升高。此外,高精料饲喂引起后段肠道内容物中总挥发性脂肪酸(Volatile fatty acid,VFA)及其各组分的含量均有不同程度的升高。本研究在三组山羊的结肠内容物中共鉴定出7种差异性代谢产物,其中β-丙氨酸,对甲苯酚和甘氨酰脯氨酸在高精料饲喂后显著高于对照组,而苏糖酸,豆甾醇,三羟基丁酸和喹啉酸显著降低。6种差异性代谢物同样在盲肠内容物中被鉴定,高精料组山羊只有β-丙氨酸显著升高,而水合乙醛酸,豆甾醇,二十烷醇,叶绿醇和喹啉酸则显著低于对照组山羊。长期高精料组山羊后段肠道内容物中微生物的ACE,Chao1和Shannon指数显著低于对照组。与对照组相比,短期高精料饲喂组结肠内容物中Shannon和盲肠内容物中ACE、Chao1指数均显著降低。在细菌的属水平上,高精料饲喂后结肠内容物中的梭菌、颤螺菌、普氏菌和拟杆菌等的丰度较对照组山羊显著升高,而瘤胃球菌等显著降低。在盲肠内容物中,随着精料比例的增加,梭菌等的丰度显著高于对照组,而颤螺菌和粪球菌等则显著降低。这些结果表明高精料日粮能引起泌乳期奶山羊后段肠道发酵参数如LPS、挥发性脂肪酸和乳酸含量的升高,降低肠腔内微生物区系的多样性并改变其整体结构,最终导致代谢紊乱。2高精料日粮对后段肠道上皮屏障功能的影响12头泌乳期奶山羊随机分为对照组(日粮精粗比为35:65)和高精料组(日粮精粗比为65:35)。饲喂10周后,高精料组山羊结肠和盲肠内容物中的淀粉、乙酸、丙酸、丁酸和总VFA的浓度均显著高于对照组。此外,高精料组山羊盲肠内容物中游离LPS浓度显著高于对照组,而在结肠内容物中没有发生变化。HE染色结果表明高精料饲喂引起结肠和盲肠上皮细胞脱落和严重的细胞损伤。通过透射电镜对后段肠道上皮细胞的超微结构进行进一步观察发现,高精料组山羊后段肠道上皮细胞的紧密连接受损、细胞间缝隙变大,而对照组山羊肠道上皮细胞具有正常的紧密连接结构。此外,对照组山羊后肠具有正常的细胞核与线粒体,然而,高精料组出现细胞核崩解和线粒体空泡化的现象。高精料日粮引起后段肠道上皮TUNEL 阳性凋亡细胞比例增加。与对照组相比,高精料饲喂使结肠黏膜caspase-3和-8的基因表达及酶活力显著升高,盲肠中caspase-3的变化与结肠一致。高精料饲喂显著下调盲肠黏膜细胞增殖指标的mRNA与蛋白表达。与对照组相比,高精料饲喂显著降低盲肠黏膜中E型前列腺素(Prostaglandin E2,PGE2)含量及其受体的表达。此外,盲肠黏膜中磷酸化CREB和AKT的蛋白丰度在高精料饲喂后均有不同程度的降低。检测细胞因子的基因表达发现高精料饲喂不影响结肠黏膜中细胞因子的基因表达。在盲肠中,高精料日粮上调TLR4、MyD88和IL-1β。本试验同样检测了紧密连接蛋白的基因和蛋白表达。后段肠道黏膜中occludin、claudin-1和claudin-4的基因表达均未受高精料日粮的影响。然而,高精料日粮组山羊结肠黏膜claudin-1和claudin-4的蛋白表达均显著高于对照组。以上结果显示长期饲喂泌乳期奶山羊高精料日粮通过激活细胞凋亡和抑制细胞增殖引起后段肠道损伤。此外,高精料日粮亦引起后段肠道局部炎症反应和紧密连接状态的改变。3 QS信号分子对肠道杯状细胞功能的影响本试验研究两种代表性的酰基高丝氨酸内酯(C12-HSL和C4-HSL)对肠道杯状细胞(LS174T细胞系)功能的影响。研究发现C12-HSL在浓度大于50 μM时显著降低细胞活力且具有时间依赖性,然而C4-HSL不影响LS174T细胞活力。对照组、100μM C4-HSL和10 μM C12-HSL处理均不影响细胞的亚显微结构,而100 C12-HSL处理4小时引起细胞线粒体空泡化的发生。100μM C12-HSL引起线粒体膜电位的显著降低。与之一致,C12-HSL同样增加线粒体超氧化物的生成。与对照组细胞相比,C12-HSL显著增加caspase-3蛋白表达。本试验也检测了 100 μM C12-HSL处理4小时对LS174T细胞线粒体呼吸链复合物活力的影响,结果显示C12-HSL显著增加复合物Ⅳ和Ⅴ的活性。此外,C12-HSL引起LS174T细胞内ATP及钙离子含量的升高并降低线粒体完整性。C12-HSL显著增加活性氧的生成且具有时间依赖性。10-200 μM的C12-HSL处理细胞4小时均引起细胞内活性氧含量的显著升高。LS174T细胞暴露于100 μM C12-HSL 1-6小时均引起细胞内活性氧含量的显著升高并且在处理4小时达到顶峰。此外,细胞内丙二醛和过氧化氢的含量在100 μM C12-HSL处理4小时后均显著升高。100 μM的C12-HSL处理细胞4 h显著下调黏蛋白MUC2的基因和蛋白表达。PAS和阿尔新蓝染色结果表明C12-HSL处理后黏蛋白的分泌和硫酸盐化水平均显著降低。使用肠上皮细胞系HCT116细胞对以上结果进行验证,结果显示大于200 μM的C12-HSL显著降低HCT116细胞活力并呈现剂量依赖性。与对照组相比,400 μM的C12-HSL显著增加细胞内和细胞上清中MUC2的含量。PAS和阿尔新蓝染色结果表明C12-HSL显著增加HCT116细胞黏蛋白和硫酸盐化水平。以上结果表明,C4-HSL(0-200 μM)和C12-HSL(10μM)并不影响杯状细胞黏蛋白的分泌,而100μM C12-HSL通过线粒体途径诱导细胞凋亡。此外,100 μM C12-HSL能够抑制黏蛋白的分泌和成熟。4 QS信号分子影响肠道杯状细胞功能的机理研究本试验使用脂筏破坏剂MβCD与C12-HSL共同处理细胞研究C12-HSL进入细胞的途径。研究发现1-10 μM的MβCD对C12-HSL诱导的细胞凋亡仅有轻微的缓解作用。然而,10μMMβCD不能改善C12-HSL引起的LS174T细胞凋亡、线粒体膜电位去极化和超氧化物的生成。为了研究对氧磷酶在C12-HSL诱导细胞损伤中的作用,本试验使用对氧磷酶的抑制剂TQ416与C12-HSL共同处理细胞。1μM TQ416能够逆转C12-HSL诱导的细胞凋亡和线粒体功能紊乱。此外,1 μM TQ416完全缓解C12-HSL诱导的细胞分泌功能障碍。当TQ416与C12-HSL同时处理细胞时,TQ416几乎完全屏蔽C12-HSL的效应。然而,当TQ416比C12-HSL晚10-30分钟处理细胞时,它的缓解能力大大降低,在晚于C12-HSL40分钟处理细胞时,TQ416的缓解效应完全消失。通过研究细胞的先天免疫反应发现,C12-HSL处理后细胞内caspase-1前体的蛋白水平显著降低,并且caspase-1的活力显著升高。细胞内IL-1β和GSDMD的蛋白表达没有受到C12-HSL处理的影响。C12-HSL诱导细胞上清中IL-1β,TNF-α和IL12P70的含量显著降低,而IL-8的浓度显著升高。此外,TLR2,3和4的基因表达被C12-HSL显著上调,然而,TLR2和TLR4的蛋白表达显著降低。磷酸化的NF-κB没有受到C12-HSL的影响,并且NF-κB转录活性抑制剂JSH-23也不能缓解C12-HSL的效应。本试验同样研究了 C12-HSL对细胞内信号通路的影响。对氧磷酶抑制剂TQ416、氧化应激清除剂NAC和Caspase-1抑制剂VX-765均能显著缓解C12-HSL诱导的细胞损伤。与C12-HSL处理组相比,细胞中活性氧、丙二醛和过氧化氢的含量在TQ416处理后显著降低。TQ416和NAC均能逆转C12-HSL诱导的caspase-1活力的增加。Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK能够缓解C12-HSL对的有害影响。TQ416、NAC和VX-765均能够抑制C12-HSL诱导的caspase-3的蛋白表达。此外,VX-765和Z-DEVD-FMK能够缓解C12-HSL对黏蛋白的效应。使用肠上皮细胞系HCT116细胞对以上结果进行验证,TQ416、VX-765和Z-DEVD-FMK同样能够显著缓解上述由C12-HSL引起的生物学效应。以上的结果表明C12-HSL通过对氧磷酶诱导肠道杯状细胞氧化应激,进而激活caspase-1&3级联信号,最终导致细胞功能紊乱。先天免疫同样参与C12-HSL对肠道杯状细胞的不良反应,细胞因子特别是IL-8可能参与其中。综上所述,本研究发现了长期饲喂高精料日粮引起泌乳期奶山羊后段肠腔内发酵模式改变、细菌生态失调和代谢紊乱。后段肠腔中的有害代谢产物破坏肠道上皮屏障,严重威胁反刍动物的肠道健康。