铝(aluminum,Al)是地壳中含量最多的金属元素。在所有的致AD的影响因素中,金属铝是被广泛研究可以引发AD组织病理学变化的重要的环境影响因素。AD临床表象为进行性的记忆力减退,其最早出现和最基本的症状就是学习记忆功能障碍,所以铝对学习记忆损伤机制的研究一直是铝神经毒作用机制研究的热点。学习记忆的基础是突触可塑性,长时程增强(1ong-term potentiation,LTP)是突触可塑性的两种主要形式之一,Al对LTP的影响就意味着可能影响突触可塑性。LTP主要依赖于AMPA受体(Alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-proprionic acid(AMPA)-type glutamate receptor,AMPAR)不断向突触后膜的插入。课题组前期研究结果发现,在慢性染铝致大鼠学习记忆损害的动物模型中,铝对LTP的损伤伴随着海马细胞内AMPA受体亚单位的表达量的降低。研究指出Akt/GSK-3β信号通路调节AMPA受体运输及调控LTP,同时Caspase-3切割降解Akt参与对突触可塑性的调节,但是铝如何通过影响AMPA受体进而影响海马CA1区LTP的机制还未完全阐明。目的:(1)探讨在亚慢性给药及侧脑室染铝情况下,不同剂量铝对大鼠海马LTP的损害作用以及在此过程中AMPA受体外化的改变;以及Caspase-3,Akt,GSK-3β是否参与了铝损害LTP。(2)同时使用Caspase-3抑制剂z-DEVD-fmk及GSK-3β抑制剂SB216763,确定Caspase-3介导的Akt/GSK-3β信号通路是否参与了铝致大鼠海马LTP及AMPA受体外化损伤,为铝致学习记忆损伤的机制研究及未来的干预研究提供有力的依据。方法:(1)32只健康成年雄性sd大鼠,在适应饲养环境1周后按体重随机分配到:生理盐水组、al(mal)3低、中、高浓度组(分别为:10μm/kg、20μm/kg、40μm/kg),每组8只。腹腔注射染毒8周后,将大鼠麻醉并将其固定在脑立体定位仪上,分别将刺激电极和记录电极精确插入到海马刺激与记录部位。通过给予海马schaffer侧枝测试刺激和一组高频刺激(highfrequencystimulation,hfs),在海马ca1区放射层记录基础fepsp和hfs引起的ltp。在电生理实验结束后断头取海马,分别提取总蛋白和膜蛋白,采用western-blot的方法检测各组大鼠细胞膜上ampar亚单位glur-1、glur-2亚基的变化情况及活化的caspase-3、akt、gsk-3β、p-gsk-3β(ser9)的蛋白表达。(2)经水合氯醛麻醉后的大鼠固定于脑立体定位仪上,用牙科水泥将带有内芯的套管植入大鼠侧脑室内,将经侧脑室套管植入术后恢复的24只sd大鼠,按体重随机分配到:生理盐水组、al(mal)3低、中、高浓度组(分别为:2mm、10mm、50mm),每组6只。在大鼠清醒安静状态下将药物推入侧脑室注射不同剂量的al溶液,每两天定时染毒,连续染毒10天。染毒结束后,在海马ca1区放射层记录基础fepsp和hfs引起的ltp。在电生理实验结束后断头取海马,分别提取总蛋白和膜蛋白,采用western-blot的方法观察各组大鼠细胞膜上ampa受体亚单位glur-1、glur-2亚基的变化情况及活化的caspase-3、akt、gsk-3β、p-gsk-3β(ser9)的蛋白表达情况。(3)将经侧脑室套管植入术后恢复的24只sd大鼠,按体重随机分配到:生理盐水组、50mmal(mal)3组、caspase-3抑制剂组、caspase-3抑制剂+50mmal(mal)3,每组6只。在大鼠清醒安静状态下将al溶液或者caspase-3抑制剂z-devd-fmk注入侧脑室,每两天定时染毒,连续染毒10天。染毒结束后,在海马ca1区放射层记录基础fepsp和hfs引起的ltp。在电生理实验结束后断头取海马,分别提取总蛋白和膜蛋白,采用western-blot的方法观察各组大鼠细胞膜上ampar亚单位glur-1、glur-2亚基的变化以情况及活化的caspase-3、akt、gsk-3β、p-gsk-3β(ser9)的蛋白表达情况。(4)将经侧脑室套管植入术后恢复的24只sd大鼠,按体重随机分配到:生理盐水组、50mmal(mal)3组、gsk-3β抑制剂组、gsk-3β抑制剂+50mmal(mal)3,每组6只。将al溶液或者gsk-3β抑制剂sb216763注入侧脑室,每两天定时染毒,连续染毒10天。染毒结束后,在海马ca1区放射层记录基础fepsp和hfs引起的ltp。在电生理实验结束后断头取海马,分别提取总蛋白和膜蛋白,采用western-blot的方法观察各组大鼠细胞膜上ampar亚单位glur-1、glur-2亚基的变化以及gsk-3β、p-gsk-3β(ser9)的蛋白表达变化情况。结果:1.亚慢性染铝实验结果电生理测定结果:对照组在高频刺激后fepsp即刻增大至(176.04±6.2)%,30min时保持在(154.5±10.4)%,60min后降低到(146.8±4.2)%;10μm/kg组fepsp幅度在高频刺激后1min、30min、60min时的幅度分别为(170.3±4.8)%、(155.0±5.8)%和(145.8±5.0)%,与对照组比较,无统计学差异(p>0.05);20μm/kg组fepsp幅度在高频刺激后1min、30min、60min时的幅度分别为(154.7±8.0)%、(141.1士4.4)%和(135.7士7.7)%;40μm/kg组fepsp幅度在高频刺激后lmin、30min、60min时的幅度分别为(141.0±9.8)%、(122.7±9.3)%和(121.0±9.3)%,20μm/kg、40μm/kg组fepsp幅度与对照组比较,1min、30min、60min时的幅度有统计学差异(p<0.05)。western-blot结果:(1)在总蛋白中,20μm/kg、40μm/kg染铝组glur1和glur2亚基含量较对照组明显下降(p<0.05);同时膜蛋白中,20μm/kg、40μm/kg剂量染铝组glur1和glur2含量亦有所下降;分析膜蛋白/总蛋白的比值发现,染铝组glur1膜蛋白/总蛋白比值呈逐渐下降的趋势,40μm/kg组与对照组相比显著下降,平均下降百分率为41.1%,差异有统计学意义(p<0.05);染铝组glur2膜蛋白/总蛋白比值亦呈逐渐下降的趋势,20μm/kg、40μm/kg组与对照组相比显著下降,平均下降百分率分别为41.2%、73%,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)10μm/kg、20μm/kg、40μm/kg各染毒组大鼠海马caspase-3活化蛋白含量随al(mal)3染毒剂量升高而逐渐升高;20μm/kg、40μm/kg染铝组与对照组相比显著升高,差异有统计学意义(p<0.05);20μm/kg、40μm/kg染铝组大鼠海马akt蛋白含量与对照组相比显著下降,差异有统计学意义(p<0.05);20μm/kg、40μm/kg染铝组大鼠海马p-gsk-3β蛋白含量与对照组相比显著升高,差异有统计学意义(p<0.05);随着al(mal)3染毒剂量升高,p-gsk-3β/gsk-3β的比值也逐渐下降,且在40μm/kg染铝组下降最为明显,与对照组及其余低剂量、中剂量组差异有统计学意义。亚慢性染铝大鼠在高频刺激后60min的fepsps的幅值与caspase-3活化蛋白表达呈负相关(r=-0.717,p<0.001);与akt、p-gsk-3β(ser9)蛋白表达呈正相关(r=0.780、0.859、p<0.001)2.侧脑室注射染铝实验结果电生理测定结果:对照组在高频刺激后fepsp即刻增大至(176.2±7.0)%,30min时保持在(155.8±11.3)%,60min后降低到(148.0±3.8)%;低剂量组fepsp幅度在高频刺激后1min、30min、60min时的幅度分别为(166.5±6.0)%、(148.8±10.1)%和(143.3±4.2)%,除1min时间点略低于对照组外(p<0.05),在其余各时间点与对照组比较,无统计学差异(p>0.05);中剂量组fepsp幅度在高频刺激后1min、30min、60min时的幅度分别为(141.9±8.2)%、(126.2士9.3)%和(124.3士8.5)%;高剂量组fepsp幅度在高频刺激后lmin的幅度为(128.5±4.4)%、30min时即恢复到基线水平(106.7±5.7)%、fepsp幅度在60min时为(104.0±5.1)%;中剂量组及高剂量组fepsp幅度与对照组比较,1min、30min、60min时的幅度有统计学差异(p<0.05)。western-blot结果:(1)在总蛋白及膜蛋白中,中、高剂量染铝组glur1和glur2亚基含量较对照组明显下降(p<0.05);分析膜蛋白/总蛋白的比值发现,侧脑室染铝的大鼠glur1膜蛋白/总蛋白比值呈逐渐下降的趋势,中、高剂量组与对照组相比显著下降,平均下降百分率分别为33.7%、34.8%,差异有统计学意义(p<0.05);侧脑室染铝的大鼠glur2膜蛋白/总蛋白比值呈逐渐下降的趋势,中、高剂量组与对照组相比显著下降,平均下降百分率分别为14.9%、20.7%,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)各染al组大鼠海马caspase-3蛋白含量随al(mal)3染毒剂量升高而逐渐升高;10mm、50mm染铝组与对照组相比显著升高,差异有统计学意义(p<0.05);10mm、50mm染铝组大鼠海马akt蛋白含量与对照组相比显著下降,差异有统计学意义(p<0.05);10mm、50mm染铝组大鼠海马p-gsk-3β蛋白含量与对照组相比显著升高,差异有统计学意义(p<0.05);随着随al(mal)3染毒剂量升高,p-gsk-3β/gsk-3β的比值也逐渐下降,且在高剂量组下降最为明显,与对照组及其余低剂量、中剂量组差异有统计学意义,意味着gsk-3β的ser9位点的磷酸化水平随着al染毒剂量的升高而下降且活性增高。侧脑室染铝大鼠在高频刺激后60min的fepsps的幅值与活化的caspase-3蛋白表达呈负相关(r=-0.775,p<0.01);与akt、p-gsk-3β(ser9)蛋白表达呈正相关(r=0.694、0.858、p<0.01);3.caspase-3抑制剂z-devd-fmk干预实验结果电生理测定结果:对照组在高频刺激后fEPSP即刻增大至(174.6±6.9)%,30min时保持在(152.4±11.1)%,60min后降低到(146.1±3.2)%;caspase-3抑制剂组的fepsp幅度在高频刺激后1min、30min、60min时的幅度分别为(170.3±3.6)%、(147.8±8.6)%和(143.2±4.6)%,与对照组相比,caspase-3抑制剂z-devd-fmk没有影响ltp,在各时间点与对照组比较,无统计学差异(p>0.05);50mmal组fepsp幅度在高频刺激后lmin的幅度分别为(130.6±5.1)%、30min时即恢复到基线水平(108.0±5.2)%、fepsp幅度在60min时为(105.2±6.1)%,与对照组比较,1min、30min、60min时的幅度有统计学差异(p<0.05),侧脑室染50mmal对大鼠海马ltp有明显的抑制作用。1min、30min、60min时的幅度分别为(148.4±2.1)%、(127.3±9.4)%和(120.0±12.3)%,在hfs后1min、30min、60min时的幅度与50mmal组比较有统计学差异(p<0.05)。侧脑室联合应用50mmal及caspase-3抑制剂z-devd-fmk拮抗了50mmal诱导的ltp损伤。western-blot结果:(1)在总蛋白中,z-devd-fmk没有影响amparglur1和glur2两种亚单位的蛋白表达量,与对照组相比且无统计学差异(p>0.05);50mmal与对照组相比显著下降,差异有统计学意义(p<0.05)。侧脑室联合应用50mmal及caspase-3抑制剂z-devd-fmk拮抗了50mmal诱导的大鼠海马总蛋白中ampa受体亚单位蛋白的减少,与50mmal组比较有统计学差异(p<0.05)。为明确caspase-3在铝损害大鼠海马中ampar外化中的作用,我们进一步分析了给与caspase-3抑制剂z-devd-fmk后,glur1及glur2亚基的膜蛋白/总蛋白比值的变化。al染毒组与对照组相比显著下降,平均下降百分率分别为20.22%和26.25%,差异有统计学意义(p<0.05);caspase-3抑制剂可以显著逆转铝致大鼠海马中glur1及glur2亚基外化损伤,膜蛋白/总蛋白比值平均提高26.76%及62.71%,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)实验结果显示单独给予caspase-3的抑制剂z-devd-fmk组的caspase-3活化蛋白表达量虽略低于对照组,但是与对照组相比,无统计学差异(p>0.05);50mmal大鼠海马的caspase-3的活化蛋白表达量升高,与对照组比,差异有统计学意义(p<0.05)。侧脑室联合应用50mmal及caspase-3抑制剂z-devd-fmk拮抗了50mmal诱导的大鼠海马caspase-3的活化蛋白表达量的增加,与50mmal组比较有统计学差异(p<0.05);单独给予caspase-3的抑制剂z-devd-fmk组的akt的蛋白表达量无变化,且与对照组相比,无统计学差异(p>0.05);50mmal大鼠海马akt蛋白含量降低,与对照组相比显著下降,差异有统计学意义(p<0.05);侧脑室联合应用50mmal及caspase-3抑制剂z-devd-fmk拮抗了50mmal诱导的大鼠海马中akt蛋白表达量的减少,与50mmal组比较有统计学差异(p<0.05);单独给予caspase-3的抑制剂z-devd-fmk没有影响大鼠海马p-gsk-3β蛋白含量,且与对照组相比,无统计学差异(p>0.05);50mmal染铝组与对照组相比显著升高,差异有统计学意义(p<0.05)。且在50mmal组,p-gsk-3β/gsk-3β的比值最小,与对照组差异有统计学意义(p<0.05),al染毒可致gsk-3β的ser9位点的磷酸化水平下降且活性增高。侧脑室联合应用50mmal及caspase-3抑制剂z-devd-fmk拮抗了50mmal诱导的gsk-3β的ser9位点的磷酸化水平下降。4.gsk-3β抑制剂sb216763干预实验结果:电生理测定结果:对照组在高频刺激后fepsp即刻增大至(174.8±6.1)%,30min时保持在(150.6±10.3)%,60min后降低到(146.0±5.9)%;gsk-3β抑制剂组的fepsp幅度在高频刺激后1min、30min、60min时的幅度分别为(187.9±17.1)%、(165.0±18.7)%和(157.6±13.7)%,与对照组相比,gsk-3β抑制剂sb216763没有影响ltp,在各时间点fepsp幅度值略高于对照组,但无统计学差异(p>0.05);染铝组fepsp幅度在高频刺激后lmin的幅度分别为(130.6±5.1)%、30min时即恢复到基线水平(108.0±5.2)%、fepsp幅度在60min时为(105.2±6.1)%,与对照组比较,1min、30min、60min时的幅度有统计学差异(p<0.05),侧脑室染50mmal对大鼠海马ltp有明显的抑制作用。侧脑室联合应用50mmal及gsk-3β抑制剂sb216763拮抗了50mmal诱导的ltp损伤。1min、30min、60min时的幅度分别为(157.7±2.1)%、(136.0±16.1)%和(128.0±15.3)%,在hfs后1min、30min、60min时的幅度与50mmal组比较有统计学差异(p<0.05)。western-blot结果:(1)50mmal染铝组与对照组相比,gsk-3β蛋白的磷酸化水平显著降低,p-gsk-3β/gsk-3β的比值最小,与对照组差异有统计学意义(p<0.05),al染毒可致gsk-3β的ser9位点的磷酸化水平下降且活性增高。单独给予gsk-3β的抑制剂sb216763增加了大鼠海马p-gsk-3β(ser9)蛋白含量,同时p-gsk-3β/gsk-3β的比值也增加即磷酸化水平增加,且与对照组相比,差异有统计学意义(p<0.05);侧脑室联合应用50mmal及gsk-3β的抑制剂sb216763逆转了50mmal诱导的gsk-3β的ser9位点的磷酸化水平下降从而使gsk-3β活性抑制。(2)在总蛋白中,sb216763没有影响amparglur1和glur2两种亚单位的蛋白表达量,与对照组相比且无统计学差异(p>0.05);与第一部分第二章的结果一致,50mmal与对照组相比显著下降,差异有统计学意义(p<0.05)。侧脑室联合应用50mmal及sb216763拮抗了50mmal诱导的大鼠海马总蛋白中ampa受体亚单位蛋白的减少,与50mmal组比较有统计学差异(p<0.05);为明确gsk-3β在铝损害大鼠海马中ampa受体外化中的作用,我们进一步分析了glur1及glur2亚基的膜蛋白/总蛋白比值的变化。al染毒组与对照组相比显著下降,平均下降百分率分别为26.76%和18.28%,差异有统计学意义(p<0.05);gsk-3β抑制剂可以显著逆转铝致大鼠海马中glur1及glur2亚基外化损伤,膜蛋白/总蛋白比值平均提高23.19%及27.63%,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:·亚慢性腹腔注射染铝及侧脑室染铝均会损害大鼠海马ltp及ampar的外化,铝可通过抑制ampar亚单位向细胞膜的运输和表达从而损害大鼠海马ltp,这种损害的程度与铝的剂量呈现一定的剂量反应关系。·侧脑室染铝模型与腹腔注射染铝模型的结果一致,可以用侧脑室连续给药的方式替代腹腔注射,以达到精确实验药物剂量以及减少因吸收、代谢等因素对实验结果造成的干扰。·铝导致的ltp损伤的潜在机制:caspase-3的活化-akt含量的减少-gsk-3β磷酸化水平降低-gsk-3β被激活-ampar在神经元细胞膜的相对表达减少,外化抑制-最终影响LTP。