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基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)属于锌离子依赖型金属蛋白酶总族中的蛋白水解酶亚族。MMPs能够调控多种细胞外基质(ECM),从而对人体骨骼生长,组织再生和器官发育等生理活动进行调控。但MMPs的失调与关节炎、心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤癌症的发生发展都有着密切的关系。其中MMP-13在炎症或肿瘤等病理环境下会大量表达,其作用方式主要分为两种:①水解细胞基底膜,促进肿瘤细胞的转移和侵袭;②作用于其它活性生物分子,从而间接影响这些生物分子调控的生理过程。目前MMP-13已经成为乳腺癌和关节炎的生物学标志,研发MMP-13的抑制剂成为治疗上述疾病的研究方向。其中催化结构域作为MMPs发挥生理功能的关键位点,成为设计研发MMPs抑制剂的主要研究对象。本论文通过基因重组技术表达了两种易于纯化的MMP-13催化结构域(cdMMP-13),并实现了对这两种cdMMP-13的复性,进而进行了结晶条件的筛选和新型抑制剂抑制机理的研究。本论文主要工作包括以下方面:1、单组氨酸标签MMP-13催化结构域(His-cdMMP-13)的制备及结晶条件的筛选诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21表达了 His-cdMMP-13,并对His-cdMMP-13进行纯化。纯化过程中比较了动态吸附和静态吸附这两种亲和色谱纯化方式,动态吸附纯化一次可上样19-22mg,获得纯度为98%的目标蛋白约13 mg左右,适用于制备药物筛选和结晶条件优化的蛋白样品;静态吸附纯化一次可上样50-55 mg,获得纯度为97%的目标蛋白44 mg左右,适用于制备性质统一的大量蛋白进行结晶条件筛选。通过排阻色谱实现了对His-cdMMP-13的复性,向复性缓冲液中添加10 A12(SO4)3或K3[Fe(CN)6]可以使His-cdMMP-13在4℃稳定存放。对稳定性较好的His-cdMMP-13与其抑制剂复合物在4℃进行结晶条件的筛选,共筛选384种条件,但无晶体生长。2、双组氨酸标签的MMP-13催化结构域(Dual-His-cdMMP-13)的制备及结晶条件筛选通过分子克隆技术获得可以表达Dual-His-cdMMP-13的质粒。对该质粒在BL21中的表达产物进行鉴定,结果表明Dual-His-cdMMP-13在BL21中以包涵体形式表达。对Dual-His-cdMMP-13进行纯化,比较了动态吸附和静态吸附这两种亲和色谱纯化方式,动态吸附纯化一次可上样17-20 mg,获得纯度为98%的目标蛋白约12 mg,适用于制备药物筛选和结晶条件优化的蛋白样品;静态吸附纯化一次可上样45-50mg,获得纯度为97%的目标蛋白40 mg左右,适用于制备性质统一的大量蛋白进行结晶条件筛选。通过排阻色谱实现了对Dual-His-cdMMP-13的复性,并考察其存放的稳定性,结果表明Dual-His-cdMMP-13的稳定性优于His-cdMMP-13,可以在16℃单独稳定存放。对Dual-His-cdMMP-13和Dual-His-cdMMP-13与其抑制剂的复合物在16℃进行了结晶条件的筛选,各筛选384种条件,其中Dual-His-cdMMP-13与其抑制剂的复合物在0.5 MNaCl、0.01 M MgCl2和0.01 M十六烷基三甲基溴化铵池液中有晶体生长,但晶形较差且晶体较小无法收集衍射数据,可对该池液条件继续优化。3、抑制剂抑制机理的研究采用荧光底物法进行动力学实验,研究了新型抑制剂对MMP-13的抑制机理,结果表明 K3[Fe(CN)6](IC50:0.5μM)的抑制作用强于 A12(SO4)3(IC50:1.8 μM),但二者对MMP-13的抑制作用都属于混合性抑制机理。同时对苦杏仁苷的抑制能力进行了探究,结果表明苦杏仁苷对MMP-13的抑制作用弱于三价金属离子及其配合物,其IC50值为17.1 μM,结合K3[Fe(CN)6]对MMP-13的抑制作用推测-CN基团在抑制MMP-13的过程中起到协同辅助的作用。