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背景
在全球范围内，每年约有550万人死于缺血性或出血性中风，中风是继缺血性心脏病之后第二大最常见的死亡原因，其特点为患病率高、死亡率高、复发率高及致残率高。目前溶栓药物治疗也被认为临床治疗急性中风关键环节，但是及时恢复缺血区血流供应又会引发更为严重的脑组织结构和功能损伤，又称为缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion, I/R)。内皮细胞(endothelial cell, EC)是血管的第一道屏障，内皮功能受损加重缺血性脑损伤。线粒体是细胞中高度活跃的细胞器，内皮细胞线粒体功能障碍最近被认为是I/R损伤后继发细胞死亡的新机制。脑血管内皮细胞(endothelial cells, ECs)和线粒体对缺血缺氧非常敏感，改善线粒体功能已被证明是改善心脑血管疾病的潜在干预措施。3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, 3-MST )主要定位于线粒体，是内源性(hydrogen sulfide, H2S)合成酶之一，是大脑中H2S产生的主要来源。3-MST/H2S具有多种功能，包括血管生成，血管舒张，抗氧化应激和促进生物能作用，但是对其在脑缺血损伤发挥的作用知之甚少。Rho激酶信号途径是心脑血管系统的重要靶点，ROCK是RhoA最重要、最直接的效应分子。RhoA/ROCK途径与内皮细胞功能关系已有许多研究，其激活可能损害线粒体动力学和能量学。因此，我们猜测内皮细胞线粒体3-MST产生的H2S通过抑制RhoA/ROCK信号通路而产生脑缺血和再灌注损伤保护作用，并通过体内体外实验探讨其角色和潜在机制。
目的：
1.细胞水平探讨3-MST生成的H2S对缺血缺氧损伤的脑血管内皮细胞和线粒体的保护作用及其相应RhoA/ROCK通路机制；
2.动物水平探讨3-MST生成的H2S对CSE-/-小鼠缺血再灌注损伤的保护作用及其相应RhoA/ROCK通路机制。
3.人体脑血管中动脉远端血管标本观察脑缺血后内皮损伤情况以及血管3-MST和H2S水平的变化。
方法：
1.大鼠原代脑血管内皮细胞培养，进行形态学和免疫荧光鉴定。建立氧糖剥夺再灌注损伤(oxygen and glucose deprivation, OGD/R)细胞模型，加入不同浓度3-巯基丙酮酸(mercaptopyruvate，3-MP)和L-天冬氨酸(L-aspartic acid，L-Asp)后MTT法检测琥珀酸脱氢酶活力变化。
1.1实验分为五组，分别是：(1)Control组；(2)OGD/R组；(3)L-Asp(10μM)组；(4)3-MP(90 nM)组；(5)3-MP+L-Asp组。(3-5组在缺氧和复氧过程均加入相应药物)
1.2实验结束后采用亚甲基蓝法和Westernblot法分别检测细胞H2S含量和3-MST蛋白表达变化。采用活性氧(reactive oxygen species, ROS)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的水平变化来评估内皮细胞损伤。
1.3原代内皮细胞用免疫荧光法检测3-MST以及RhoA,ROCK1和ROCK2线粒体定位，同时差速离心法分离获得纯化线粒体，用Westernblot法再次进行上述蛋白线粒体定位的鉴定。
1.4实验结束后用荧光染料7-叠氮基-4-甲基香豆素(AzMC)检测线粒体H2S含量变化，Westernblot法检测线粒体3-MST和ATP5D蛋白表达变化。同时检测以下线粒体功能损伤相关指标：透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)观察线粒体超微结构变化；MitoSOX荧光探针检测线粒体活性氧水平；酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测线粒体ATP合酶活性；化学发光法检测线粒体ATP含量；JC-1染料法检测线粒体膜电位变化。
1.5实验结束，对纯化的线粒体除外细胞裂解液和线粒体采用ELISA法检测RhoA活力,Westernblot法检测ROCK1和ROCK2表达水平。
2.采用大脑中动脉线栓栓塞和拔除法建立局灶性脑缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)，实验结束后采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法和ZeaLonga神经功能评分法检测脑缺血损伤情况。
2.1采用激光散斑血流成像(laser speckle flowgraphy, LSFG)技术检测各组小鼠手术前，栓塞后，拔出线栓再灌注颈总动脉给药后10min,1h和22h的脑血流量(cerebral blood flow, CBF)。
2.2实验结束后，采用苏木素-伊红(HE)染色法检测脑中动脉血管内皮形态学变化，并检测血管H2S水平变化。免疫组化法检测中动脉血管RhoA,ROCK1和ROCK2蛋白表达变化。
3.收集大面积脑梗死患者(massive cerebral infarction, MCI)和脑内深部良性肿瘤患者正常部位的大脑中动脉远端皮层脑血管；HE染色和TEM观察脑血管内皮的形态学变化；亚甲基蓝法检测H2S含量的变化；免疫荧光法(IF)和Westernblot检测血管组织中3-MST蛋白的表达。
结果：
1.与对照组相比，内皮细胞OGD(4h)-R(20 h)损伤模型中，内皮细胞琥珀酸脱氢酶活力显著降低(P<0.01)，3-MP(10, 30, 90 nM)预处理能够浓度梯度增加琥珀酸脱氢酶活力(P<0.01)，L-Asp(1μM及以上)预孵进一步加重OGD/R导致的细胞损伤(P<0.05；P<0.01)，3-MP(90 nM)增加的细胞活力能够被0.3μM及以上L-Asp显著抑制。AzMC探针和亚甲基蓝法检测结果显示，OGD/R损伤后内皮细胞H2S含量明显下降，L-Asp(10μM)预孵进一步抑制细胞H2S产生(P<0.05)，3-MP(90 nM)预孵能够显著增加细胞H2S含量，3-MP的这种作用能够被L-Asp明显抑制。同样，与L-Asp作用相反，3-MP预孵能够显著增加OGD/R导致的3-MST的表达的下降。
2.与对照组相比，内皮细胞OGD/R损伤后，细胞发生氧化应激损伤和能量代谢障碍，表现为显著升高的ROS水平，降低的T-AOC水平，同时ATP含量下降(P<0.01)。荧光探针和流式细胞术证实3-MP预孵能够显著抑制细胞ROS水平，提升T-AOC和ATP水平，而L-Asp预处理表现出相反的作用。
3.免疫荧光和Westernblot实验结果显示3-MST不仅定位于内皮细胞胞浆，而且定位于线粒体。与对照组相比，AzMC探针检测到线粒体H2S荧光在OGD/R损伤后明显下降。与模型组相比，L-Asp预孵进一步降低线粒体H2S荧光，而3-MP预孵能够逆转线粒体H2S荧光的衰退。对纯化的线粒体进行免疫印迹检测，结果显示与对照组相比，OGD/R损伤后线粒体3-MST表达下降(P<0.01)；与模型组相比，3-MP预孵能够增加线粒体3-MST表达(P<0.01)，3-MP的这种作用能够被L-Asp预处理减弱。
4.与对照组相比，内皮细胞线粒体OGD/R损伤后，线粒体发生功能障碍，主要表现为超微结构的破坏，线粒体ROS的增加(P<0.01)，线粒体ATP合酶活性下降(P<0.01)及其重要亚基ATP5D表达显著抑制，导致ATP产生减少(P<0.01)，与此同时，线粒体膜电位显著下降。与L-Asp作用相反，3-MP预孵能显著逆转线粒体功能损伤的这些指标，差异具有统计学意义。
5.与对照组相比，OGD/R损伤后，线粒体除外细胞裂解液和线粒体中RhoA活性、ROCK1和ROCK2表达显著增加，L-Asp预处理略微增加RhoA活性、ROCK1和ROCK2表达，尤其在线粒体外细胞裂解液中ROCK2表达显著增加(P<0.05)。与模型组相比，3-MP预处理能明显抑制各组RhoA活性、ROCK1和ROCK2表达(P<0.01)。
6.CSE-/-小鼠经MCAO/R损伤后，TTC染色梗死区和神经功能评分显著增加，提示模型建立成功。LSI结果显示模型组脑CBF明显下降(P<0.01)，颈总动脉L-Asp再灌注给药对脑CBF有一定抑制作用(P<0.05)。但3-MP预处理能增加再灌注22h后的脑CBF(P<0.05)。HE染色结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠脑中动脉内皮形态结构明显受损，3-MP颈总动脉预处理组内皮结构相对完整，细胞排列整齐。
7.亚甲基蓝实验结果显示，CSE-/-小鼠经MCAO/R损伤后，血管中动脉H2S含量显著下降，与L-Asp作用相反，3-MP显著提升血管组织H2S含量。免疫组织化学结果显示,缺血再灌注损伤后，CSE-/-小鼠脑血管内皮RhoA,ROCK1和ROCK2组织化学染色深度显著增加，与L-Asp处理作用相反，3-MP预处理显著减少其染色深度。
8.与非缺血组相比，MCI患者大脑中动脉血管内皮和线粒体形态结构发生损伤性改变，表现为内皮结构破损，EC胞膜破损，核染色质边集，线粒体肿胀，出现嵴的断裂、消失甚至空泡化。同时，MCI患者血管H2S含量明显下降(P<0.05)，3-MST蛋白表达显著下调(P<0.01)。
结论：
1.在大鼠脑血管内皮细胞缺氧复氧性损伤中，3-MST产生的H2S发生了明显的减少。
2.3-MST产生的H2S对体外缺氧复氧性损伤内皮细胞具有保护作用，与抑制线粒体氧化应激和促进能量代谢有关。
3.3-MST产生的H2S对内皮细胞缺氧复氧性损伤的保护作用，与抑制细胞和线粒体RhoA/ROCK信号通路有关。
4.3-MST产生的H2S对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，此作用与抑制内皮RhoA/ROCK信号通路保护内皮增加血流量有关。
5.人体标本提示脑中动脉3-MST、H2S的下调与缺血性中风相关。
在全球范围内，每年约有550万人死于缺血性或出血性中风，中风是继缺血性心脏病之后第二大最常见的死亡原因，其特点为患病率高、死亡率高、复发率高及致残率高。目前溶栓药物治疗也被认为临床治疗急性中风关键环节，但是及时恢复缺血区血流供应又会引发更为严重的脑组织结构和功能损伤，又称为缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion, I/R)。内皮细胞(endothelial cell, EC)是血管的第一道屏障，内皮功能受损加重缺血性脑损伤。线粒体是细胞中高度活跃的细胞器，内皮细胞线粒体功能障碍最近被认为是I/R损伤后继发细胞死亡的新机制。脑血管内皮细胞(endothelial cells, ECs)和线粒体对缺血缺氧非常敏感，改善线粒体功能已被证明是改善心脑血管疾病的潜在干预措施。3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, 3-MST )主要定位于线粒体，是内源性(hydrogen sulfide, H2S)合成酶之一，是大脑中H2S产生的主要来源。3-MST/H2S具有多种功能，包括血管生成，血管舒张，抗氧化应激和促进生物能作用，但是对其在脑缺血损伤发挥的作用知之甚少。Rho激酶信号途径是心脑血管系统的重要靶点，ROCK是RhoA最重要、最直接的效应分子。RhoA/ROCK途径与内皮细胞功能关系已有许多研究，其激活可能损害线粒体动力学和能量学。因此，我们猜测内皮细胞线粒体3-MST产生的H2S通过抑制RhoA/ROCK信号通路而产生脑缺血和再灌注损伤保护作用，并通过体内体外实验探讨其角色和潜在机制。
目的：
1.细胞水平探讨3-MST生成的H2S对缺血缺氧损伤的脑血管内皮细胞和线粒体的保护作用及其相应RhoA/ROCK通路机制；
2.动物水平探讨3-MST生成的H2S对CSE-/-小鼠缺血再灌注损伤的保护作用及其相应RhoA/ROCK通路机制。
3.人体脑血管中动脉远端血管标本观察脑缺血后内皮损伤情况以及血管3-MST和H2S水平的变化。
方法：
1.大鼠原代脑血管内皮细胞培养，进行形态学和免疫荧光鉴定。建立氧糖剥夺再灌注损伤(oxygen and glucose deprivation, OGD/R)细胞模型，加入不同浓度3-巯基丙酮酸(mercaptopyruvate，3-MP)和L-天冬氨酸(L-aspartic acid，L-Asp)后MTT法检测琥珀酸脱氢酶活力变化。
1.1实验分为五组，分别是：(1)Control组；(2)OGD/R组；(3)L-Asp(10μM)组；(4)3-MP(90 nM)组；(5)3-MP+L-Asp组。(3-5组在缺氧和复氧过程均加入相应药物)
1.2实验结束后采用亚甲基蓝法和Westernblot法分别检测细胞H2S含量和3-MST蛋白表达变化。采用活性氧(reactive oxygen species, ROS)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的水平变化来评估内皮细胞损伤。
1.3原代内皮细胞用免疫荧光法检测3-MST以及RhoA,ROCK1和ROCK2线粒体定位，同时差速离心法分离获得纯化线粒体，用Westernblot法再次进行上述蛋白线粒体定位的鉴定。
1.4实验结束后用荧光染料7-叠氮基-4-甲基香豆素(AzMC)检测线粒体H2S含量变化，Westernblot法检测线粒体3-MST和ATP5D蛋白表达变化。同时检测以下线粒体功能损伤相关指标：透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)观察线粒体超微结构变化；MitoSOX荧光探针检测线粒体活性氧水平；酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测线粒体ATP合酶活性；化学发光法检测线粒体ATP含量；JC-1染料法检测线粒体膜电位变化。
1.5实验结束，对纯化的线粒体除外细胞裂解液和线粒体采用ELISA法检测RhoA活力,Westernblot法检测ROCK1和ROCK2表达水平。
2.采用大脑中动脉线栓栓塞和拔除法建立局灶性脑缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)，实验结束后采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法和ZeaLonga神经功能评分法检测脑缺血损伤情况。
2.1采用激光散斑血流成像(laser speckle flowgraphy, LSFG)技术检测各组小鼠手术前，栓塞后，拔出线栓再灌注颈总动脉给药后10min,1h和22h的脑血流量(cerebral blood flow, CBF)。
2.2实验结束后，采用苏木素-伊红(HE)染色法检测脑中动脉血管内皮形态学变化，并检测血管H2S水平变化。免疫组化法检测中动脉血管RhoA,ROCK1和ROCK2蛋白表达变化。
3.收集大面积脑梗死患者(massive cerebral infarction, MCI)和脑内深部良性肿瘤患者正常部位的大脑中动脉远端皮层脑血管；HE染色和TEM观察脑血管内皮的形态学变化；亚甲基蓝法检测H2S含量的变化；免疫荧光法(IF)和Westernblot检测血管组织中3-MST蛋白的表达。
结果：
1.与对照组相比，内皮细胞OGD(4h)-R(20 h)损伤模型中，内皮细胞琥珀酸脱氢酶活力显著降低(P<0.01)，3-MP(10, 30, 90 nM)预处理能够浓度梯度增加琥珀酸脱氢酶活力(P<0.01)，L-Asp(1μM及以上)预孵进一步加重OGD/R导致的细胞损伤(P<0.05；P<0.01)，3-MP(90 nM)增加的细胞活力能够被0.3μM及以上L-Asp显著抑制。AzMC探针和亚甲基蓝法检测结果显示，OGD/R损伤后内皮细胞H2S含量明显下降，L-Asp(10μM)预孵进一步抑制细胞H2S产生(P<0.05)，3-MP(90 nM)预孵能够显著增加细胞H2S含量，3-MP的这种作用能够被L-Asp明显抑制。同样，与L-Asp作用相反，3-MP预孵能够显著增加OGD/R导致的3-MST的表达的下降。
2.与对照组相比，内皮细胞OGD/R损伤后，细胞发生氧化应激损伤和能量代谢障碍，表现为显著升高的ROS水平，降低的T-AOC水平，同时ATP含量下降(P<0.01)。荧光探针和流式细胞术证实3-MP预孵能够显著抑制细胞ROS水平，提升T-AOC和ATP水平，而L-Asp预处理表现出相反的作用。
3.免疫荧光和Westernblot实验结果显示3-MST不仅定位于内皮细胞胞浆，而且定位于线粒体。与对照组相比，AzMC探针检测到线粒体H2S荧光在OGD/R损伤后明显下降。与模型组相比，L-Asp预孵进一步降低线粒体H2S荧光，而3-MP预孵能够逆转线粒体H2S荧光的衰退。对纯化的线粒体进行免疫印迹检测，结果显示与对照组相比，OGD/R损伤后线粒体3-MST表达下降(P<0.01)；与模型组相比，3-MP预孵能够增加线粒体3-MST表达(P<0.01)，3-MP的这种作用能够被L-Asp预处理减弱。
4.与对照组相比，内皮细胞线粒体OGD/R损伤后，线粒体发生功能障碍，主要表现为超微结构的破坏，线粒体ROS的增加(P<0.01)，线粒体ATP合酶活性下降(P<0.01)及其重要亚基ATP5D表达显著抑制，导致ATP产生减少(P<0.01)，与此同时，线粒体膜电位显著下降。与L-Asp作用相反，3-MP预孵能显著逆转线粒体功能损伤的这些指标，差异具有统计学意义。
5.与对照组相比，OGD/R损伤后，线粒体除外细胞裂解液和线粒体中RhoA活性、ROCK1和ROCK2表达显著增加，L-Asp预处理略微增加RhoA活性、ROCK1和ROCK2表达，尤其在线粒体外细胞裂解液中ROCK2表达显著增加(P<0.05)。与模型组相比，3-MP预处理能明显抑制各组RhoA活性、ROCK1和ROCK2表达(P<0.01)。
6.CSE-/-小鼠经MCAO/R损伤后，TTC染色梗死区和神经功能评分显著增加，提示模型建立成功。LSI结果显示模型组脑CBF明显下降(P<0.01)，颈总动脉L-Asp再灌注给药对脑CBF有一定抑制作用(P<0.05)。但3-MP预处理能增加再灌注22h后的脑CBF(P<0.05)。HE染色结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠脑中动脉内皮形态结构明显受损，3-MP颈总动脉预处理组内皮结构相对完整，细胞排列整齐。
7.亚甲基蓝实验结果显示，CSE-/-小鼠经MCAO/R损伤后，血管中动脉H2S含量显著下降，与L-Asp作用相反，3-MP显著提升血管组织H2S含量。免疫组织化学结果显示,缺血再灌注损伤后，CSE-/-小鼠脑血管内皮RhoA,ROCK1和ROCK2组织化学染色深度显著增加，与L-Asp处理作用相反，3-MP预处理显著减少其染色深度。
8.与非缺血组相比，MCI患者大脑中动脉血管内皮和线粒体形态结构发生损伤性改变，表现为内皮结构破损，EC胞膜破损，核染色质边集，线粒体肿胀，出现嵴的断裂、消失甚至空泡化。同时，MCI患者血管H2S含量明显下降(P<0.05)，3-MST蛋白表达显著下调(P<0.01)。
结论：
1.在大鼠脑血管内皮细胞缺氧复氧性损伤中，3-MST产生的H2S发生了明显的减少。
2.3-MST产生的H2S对体外缺氧复氧性损伤内皮细胞具有保护作用，与抑制线粒体氧化应激和促进能量代谢有关。
3.3-MST产生的H2S对内皮细胞缺氧复氧性损伤的保护作用，与抑制细胞和线粒体RhoA/ROCK信号通路有关。
4.3-MST产生的H2S对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，此作用与抑制内皮RhoA/ROCK信号通路保护内皮增加血流量有关。
5.人体标本提示脑中动脉3-MST、H2S的下调与缺血性中风相关。