牛初乳中乳铁蛋白和免疫球蛋白G分离与纯化的研究

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乳铁蛋白(lactoferrin, LF)和免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)是牛初乳中的两种主要生物活性蛋白,具有调节免疫力、促进生长发育和抗肿瘤等一系列重要的生物功能。因此,开发和利用牛初乳中的LF和IgG具有十分重要的意义。特殊的合成方法和配基设计方案使SPEC70 SLS阳离子交换树脂和MEP Hypercel疏水与离子交换双功能树脂在分别吸附分离LF和IgG方面具有极大的优势和潜力。本文主要对SPEC 70 SLS树脂一步色谱法分离牛脱脂乳中LF和MEP Hypercel树脂高效分离其中IgG的工艺进行了研究,以进一步用于液固循环流化床(liquid-solid circulating fluidized bed, LSCFB)等工业化装置在分离牛乳蛋白方面的应用研究。论文首先优化了SPEC 70 SLS树脂对LF标准溶液的吸附工艺,研究发现吸附过程中SPEC 70 SLS树脂的分散程度对吸附过程有重要的影响。50 r/min机械搅拌条件下,SPEC 70 SLS树脂对LF标准溶液的吸附平衡时间为30 min,远低于恒温振荡器中的平衡吸附时间3 h。对牛脱脂乳中LF吸附平衡时间为50min,解吸时间小于5min。SPEC 70 SLS树脂对LF的吸附量随pH升高并接近其pI而增大,但为保持牛脱脂乳的理化性质和风味,最佳吸附pH确定为pH 7。SPEC 70 SLS树脂对LF的吸附可以用Langmuir吸附等温线模型描述,最大吸附容量qm为21.73 mg/g,吸附平衡的解离常数Kd为0.01463mg/mL。SPEC 70SLS树脂吸附牛脱脂乳中的LF和乳过氧化物酶(Lactoperoxidase, LP)可分别用330和850mM NaCl进行洗脱,吸附容量分别为8.34和7.29 mg/g树脂,纯度分别为96.7%和96.3%。此外,SPEC 70 SLS树脂对LF的回收率为74.50%,优于已报道的分离工艺方法。牛初乳粉乳清经40%(NH4)2SO4沉淀后的样品溶液中IgG纯度达80%,本文以此为初始样品溶液考察了IgG浓度、离子强度、吸附pH及停留时间对MEPHypercel层析动态吸附容量的影响。MEP Hypercel层析树脂吸附容量并不受样品溶液中IgG浓度的影响;当离子强度(NaCl浓度)低于0.5 M时,吸附容量未发生明显变化;但其对pH较为敏感,在pH 7时吸附容量最大。层析柱中IgG停留时间为15 min时,IgG回收率超过90%,而且树脂吸附量趋于最大。论文在不同离子强度下,pH梯度洗脱优化了MEP Hypercel层析吸附牛初乳乳清IgG后的洗脱工艺。优化后的洗脱工艺确定为:pH 7的牛初乳乳清上样,相同pH的PB缓冲溶液冲洗柱子,含0.5M NaCl的pH 5.5醋酸钠缓冲溶液洗脱小分子杂蛋白,pH 4.5醋酸钠缓冲溶液洗脱IgG, pH4.0醋酸钠缓冲溶液洗脱并再生层析柱。分离得到的IgG纯度高达93.9%,回收率达91.5%。在优化SPEC 70 SLS和MEP Hypercel树脂分别对牛脱脂乳中LF和IgG分离工艺后,分析了其在LSCFB中应用的可行性。SPEC70 SLS树脂湿重密度为1065 kg/m3,沉降速度为0.0085 m/s,根据类似文献报道满足LSCFB对吸附剂的基本要求。MEP Hypercel树脂的湿重密度与牛乳清接近,因此不适合在LSCFB中应用。最后,为满足SPEC 70 SLS树脂对牛乳中LF吸附后多级洗脱的要求,论文设计了含多级洗脱装置的新型LSCFB。
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