进行性肌营养不良是一类由基因突变所导致的肌肉变性病,临床上主要表现为缓慢进行性发展的肌肉萎缩和肌无力。病理上以骨骼肌纤维变性、坏死为主要特点,根据临床表现和突变基因的不同,主要分为Duchenne肌营养不良(DMD)、肢带型肌营养不良等类型。Duchenne型肌营养不良,是由DMD基因突变导致的一种X-连锁隐性遗传的致死性肌病,主要以缓慢进行性加重的对称性肌无力和肌萎缩为特点,在新生男婴中的发病率约为1/3500,迄今尚无有效的治疗方法。Mdx小鼠是目前广泛使用的DMD的动物模型。然而,与DMD患者相比,Mdx小鼠较短的寿命和较轻的肌肉病理表型,并没有精准的模拟DMD患者的临床症状,不能作为临床药物筛选安全评估的有效动物模型。尽管已经产生了例如猪和狗等个体更大的DMD动物模型,但这些大型动物的实验成本太高,很难在实验室得到普遍应用。肢带型肌营养不良型-2L(LGMD2L)是由编码anoctamin-5(ANO5)的基因突变引起的常染色体隐性肌营养不良症,其属于anoctamin蛋白家族。完全破坏ANO5基因的两个独立品系小鼠并没有表现出明显的肌营养不良表型。相比之下,报道具有截短的ANO5蛋白表达的敲除小鼠显示出肌膜损伤和非常轻微的肌肉病理学变化。目前尚不清楚这些ANO5敲除小鼠病理表型产生差异的原因,因此,需要开发新物种的动物模型来进行相关研究。目前,关于以上疾病均缺少有效的治疗措施和合适的动物模型,因此,建立更好的模拟人类肌营养不良症一类疾病的动物模型、筛选有效的药物和治疗方法迫在眉睫。兔子,作为建立疾病模型的新型物种,其与小鼠和大鼠相比,在生理学、解剖学和遗传学上与人类更为相似;与狗及猪相比,其妊娠周期更短、饲养费用更低,操作更为简单。目前,在世界范围内,有关兔作为肌营养不良症疾病动物模型的研究还处于空白。因此,兔疾病模型的构建,将为更好的模拟人类遗传性疾病提供可靠、理想的动物模型。在本研究中,我们通过将Cas9 mRNA和靶向DMD基因的外显子51的sgRNA共注射到兔受精卵中而产生兔DMD模型。DMD敲除兔成功表现出典型的DMD患者临床表型,包括严重受损的运动机能,血清肌酸激酶水平升高和进行性肌肉坏死和纤维化。此外,在5个月大敲除兔的膈肌和心脏中也观察到明显与DMD患者相类似的病理学变化。超声心电图的结果显示,DMD敲除兔表现有心室扩张,射血分数和缩短分数均降低。这种新型兔DMD模型成功模拟了DMD患者的组织病理学病变和心脏功能缺陷,弥补了其他动物模型存在的不足。截至目前,研究发现许多和ANO5基因突变相关的患者都存在小片段插入或缺失。为了更好地模拟人类ANO5突变患者,我们成功构建了ANO5基因12或13外显子的小插入或缺失,该基因编辑兔在出生时没有展现出病理变化,直到12月龄才显示出典型的肌营养不良的特征,包括血清肌酸激酶(CK)增加,肌肉坏死、再生,脂肪替代和纤维化,这种年龄依赖性的特征与临床患者相类似。新型的ANO5突变的兔模型可用于对ANO5缺陷性肌营养不良症发病机理和治疗方法的研究。此外,我们对成功建立的DMD和ANO5基因编辑兔进行外显子跳跃的研究,发现DMD和ANO5基因敲除兔均存在外显子跳跃,为了进一步探索外显子跳跃的发生机制,我们对20余种基因编辑兔模型的外显子跳跃形式进行了研究,发现基因编辑技术引起的提前终止突变(PTC)可导致外显子跳跃。综上所述,本研究成功构建的DMD及ANO5基因编辑兔,与其他动物模型相比,更好的模拟了人类Duchenne型及肢带型肌营养不良症,为该类疾病的临床药物筛选及病理机制研究提供了理想的动物疾病模型。同时,发现提前终止突变(PTC)是导致CRISPR/Cas9介导外显子跳跃的关键因素。