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酵母中普遍存在葡萄糖到甘油代谢途径,对酿酒酵母的研究表明,葡萄糖分解生成磷酸二羟丙酮(DHAP),DHAP在关键酶NAD+依赖性3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)催化下还原为3-磷酸甘油。3-磷酸甘油在3-磷酸甘油酯酶(GPP)的作用下脱磷酸根而形成甘油。这两个酶分别有两个同工酶,其中GPD1和GPP2受渗透压诱导高表达。产甘油假丝酵母WL2002-5具有耐高渗且高产甘油的特性,本课题组已通过染色体步移法首次成功克隆了来源于产甘油假丝酵母的胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因CgGPD1,通过基因序列比对,发现该基因是全新的基因,有关该酶的酶学性质的研究未见报道,为了能更好的解释该酶在高渗条件下保持高酶活和产甘油假丝酵母的耐高渗甘油合成的代谢机理,因此对该酶的酶学性质的研究显得十分迫切。在前期研究的基础上,首先,本课题以产甘油假丝酵母基因组DNA为模板,扩增得到3-磷酸甘油脱氢酶编码基因CgGPD1,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,利用表达载体pET-28a(+)上的6His·Tag标记选用Ni2+柱纯化具有表达活性的3-磷酸甘油脱氢酶(CgGPD1),纯化后比酶活达到152.6mU/mg,并初步研究了该酶的酶学性质并与酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶ScGPD1的酶学性质进行了比较。研究发现:两种蛋白分子量大小基本相同,CgGPD1的最适pH为6.2,而ScGPD1为6.8;CgGPD1在pH3.5-7.5范围内稳定性良好,ScGPD1在pH4.5-6.2范围内稳定;CgGPD1最适温度为25℃,ScGPD1为37℃;二者均在-20℃表现出很好的稳定性;CgGPD1受Mg2+激活明显,受Zn2+完全抑制,进一步通过在产甘油假丝酵母发酵培养基中单独添加这两种离子来指导甘油发酵,ScGPD1同样受Mg2+激活,受Zn2+完全抑制;以DHAP为底物CgGPD1的Km值为0.55mmol/L,Vmax为1.06umol/(mg/min),ScGPD1的Km值为0.75mmol/L,Vmax为0.51umol/(mg/min)。其次,本研究从酿酒酵母中扩增了3-磷酸甘油酯酶编码基因GPP2(ScGPP2),构建重组菌株pET28a-ScGPP2/BL21,在大肠杆菌中对ScGPP2进行诱导表达、纯化和酶学性质的初步研究。研究发现,ScGPP2大小约为31KDa,最适pH为4.5,在pH5.5-7.5范围内具有较好的稳定性;最适温度为55℃,在4℃和-20℃均有较好的稳定性,受到Mg2+和Fe3+的激活,而Zn2+、Sn2+、Mn2+离子对该酶呈完全抑制状态;以不同浓度的3-磷酸甘油为底物,测得该酶的Km值为0.55mmol/L,Vmax为0.30umol/(mg/min)。以3-磷酸甘油为底物,进行菌株pET28a-ScGPP2/BL21的全细胞转化,证明了该酶良好的转化性能,该酶能有效的将底物3-磷酸甘油转化为甘油。最后,我们在大肠杆菌中尝试了葡萄糖到甘油代谢途径的重构。即将基因CgGPD1和ScGPP2串联表达,构建了pEtac-CgGPD1-ScGPP2/BL21重组菌株。在1%的葡萄糖的条件下,甘油最高产量可达到1.56g/L。