研究背景及目的:基因治疗是目前国内外研究的热点之一,近年来作为基础的病毒载体的研究有了突飞猛进的进展。腺病毒载体转导目的基因高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点,已被认为是最为有效的转基因载体之一,并广泛运用于人类基因治疗。但是,宿主的免疫反应仍然是获得转基因长期表达和重复使用腺病毒载体的主要障碍。到目前为止,腺病毒载体共有三代载体。第一代腺病毒载体中,E1/E3基因表达盒已经去除了,但E1区表达的缺失不利于载体的转录表达,主要是由于受到了针对病毒包壳和转基因表达产物的免疫反应,而使基因表达受到抑制。为抑制发生的免疫反应,提高基因转导效率,之后构建的腺病毒载体中去除了部分或全部的E2基因,造成病毒基因的缺失或突变,减弱病毒蛋白的表达,并且加入可以调控基因表达的温敏因子,消除了复制DNA和产生可复制腺病毒(载体)(Replication Competent Adenovirus, RCA)的可能性,也就是所谓的第二代腺病毒载体。更为“复杂”的腺病毒载体就是第三代腺病毒载体,在其构建时去除了某些病毒基因,甚至是去除了全部的病毒基因;既所谓的“空壳”载体起先只保留了反向末端重复序列(inverted terminal repeats, ITR)和包装信号,且在产生中需要辅助病毒和合适的互补包装细胞,更需要进一步的纯化,常称为辅助病毒依赖型腺病毒或空壳腺病毒或具有高包装能力的腺病毒(high-capacity or gutted or helper-dependent Adenovirus vectors, HD-AdV)。腺病毒载体引起机体免疫反应的主要有:固有免疫和获得性免疫。腺病毒载体进入机体首先启动的是固有免疫系统,固有免疫反应主要是嗜中性粒细胞、单核巨噬细胞、NK细胞等的激活并吞噬进入机体的病毒载体及转导产物。在这些细胞激活后会分泌一些细胞因子,其中IL-2、IL-6和TNF-a由单核巨噬细胞等多种细胞产生,对急性炎症反应和免疫增强都有非常重要的作用。获得性免疫又分为细胞免疫和体液免疫,细胞免疫反应主要是机体产生细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocytes, CTL)特异性杀伤和消除转导靶细胞。体液免疫则通过机体产生特异性抗体来消除腺病毒载体和转导产物。IL-2,IL-6和TNF-a等细胞因子是固有免疫和急性炎症反应的关键因子,也在适应性免疫中起到了重要作用。另外,细胞免疫中目前已知T细胞被激活和增殖至少需要两个信号,第一信号是活化T细胞的必需条件,但要使之对病毒或转导产物抗原的特异性CTL增殖并获得全部效应功能,尚需要第二信号,即共刺激分子与T细胞表面的相应受体间的相互作用。能够传递第二信号的共刺激分子主要包括B7分子家族、细胞黏附分子和LFA-3等,其中B7-1(CD80)与T细胞表面的CD28结合能诱导IL-2等淋巴因子的分泌,是决定第一信号能否产生T细胞功能性激活的关键因素。本课题拟用SPF级饲养的SD大鼠作为实验动物,通过蛛网膜下腔和腹腔两种注射途径,比较第一代腺病毒载体和第三代腺病毒载体注射后不同时间点免疫反应相关指标的变化。用ELISA法检测不同时间点大鼠血清中IL-2、IL-6和TNF-α等细胞因子的含量和血清中免疫球蛋白IgG的含量;流式细胞仪检测病毒注射后不同时间点脾脏细胞共刺激分子CD80表达变化;另外用HE染色的方法观察病毒腹腔注射后肺组织炎症浸润情况。通过以上方法来分析比较两种腺病毒载体的免疫反应差异。方法:1、IL-2、IL-6、TNF-a等细胞因子的检测:动物实验分组,SD大鼠共分两大组:蛛网膜下腔注射组和腹腔注射组,其中每组再分为第一代腺病毒载体注射组、第三代腺病毒载体注射组、对照组(生理盐水注射组)。分别于不同时间点(注射前当天T0,注射后1天T1,注射后3天T2,注射后7天T3,注射后14天T4)采眼眶后静脉血,1000r/min离心20min取上清-20℃保存。用ELISA法检测血清中IL-2、IL-6、TNF-a等的含量。2、共刺激分子B7-1(CD80)的检测:动物实验分组,SD大鼠共分两大组:蛛网膜下腔注射组和腹腔注射组,其中每组再分第一代腺病毒载体注射组、第三代腺病毒载体注射组、对照组(生理盐水注射组)。分别于不同时间点(注射前当天T0,注射后1天T1,注射后3天T2,注射后7天T3,注射后14天T4),麻醉后处死SD大鼠,取大鼠脾脏研磨成细胞悬液后用流式细胞仪检测脾脏细胞CD80分子表达情况,CD80分子一抗用PE标记。3、大鼠IgG的测定:动物实验分组同上,分别于不同时间点(注射前当天T0,注射后1天T1,注射后3天T2,注射后7天T3,注射后14天T4),取眼眶后静脉血1000r/min离心20min取上清-20℃保存。用ELISA测定血清中IgG含量。4、HE染色检测肺部组织炎症浸润情况:病毒腹腔注射后,第一代腺病毒载体注射组、第三代腺病毒载体注射组、对照组(生理盐水注射组)。分别于不同时间点(注射前当天T0,注射后1天T1,注射后3天T2,注射后7天T3,注射后14天T4),麻醉后处死SD大鼠,取肺组织,多聚甲醛固定保存,检测。结果:1.注射前(T0),各组指标无显著差异。2.固有免疫反应检测结果:病毒载体经蛛网膜下腔和腹腔注射SD大鼠后,同时间点血清中IL-6、TNF-a等因子分泌水平,第一代腺病毒载体注射组均高于第三代腺病毒载体注射组,而且两组均高于对照组。3.细胞免疫反应检测结果:病毒载体经蛛网膜下腔和腹腔注射SD大鼠后,3天和7天脾脏中共刺激分子CD80的表达第一代腺病毒载体注射组均高于第三代腺病毒载体注射组,而且两组均高于对照组;同时间点血清中IL-2分泌水平,第一代注射组高于第三代注射组,而且两组均高于对照组。4.体液免疫反应检测结果:病毒载体经蛛网膜下腔和腹腔注射SD大鼠后,同时间点血清IgG的含量,第一代腺病毒载体注射组高于第三代腺病毒载体注射组,而且两组均高于对照组。5.两代病毒载体经腹腔注射SD大鼠后,肺组织HE染色显示各组间无显著差异。结论:成功的用动物实验的方法比较了两种腺病毒载体的免疫反应。固有免疫反应指标,检测了病毒注射后血清中IL-6、TNF-a等因子分泌水平;细胞免疫反应指标,检测了病毒注射后血清中IL-2分泌水平和脾脏细胞CD80表达情况;体液免疫反应,检测了病毒注射后血清中IgG的含量。通过不同免疫反应阶段的检测得出结论:第三代腺病毒载体的免疫反应低于第一代腺病毒载体,说明了第三代腺病毒载体由于其较弱的免疫反应,更适用于基因治疗,同时也为基因治疗开拓了更为广阔的前景。但从实验结果可以看出第三代腺病毒载体还是能够引起一定的免疫反应,为我们的研究工作提出了新的问题,这就要求我们在以后的科研工作中要寻求方法进一步完善腺病毒载体,争取将其免疫反应降到最低。