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生物钟基因Rev-erbα缺失对雌性小鼠生殖的影响当今社会不孕不育的比例大幅上升已经到了一种前所未有的地步,显然已经成为了一种社会难题。在不能生育的家庭中,女方因素占40%~50%。对于女性不孕不育的原因分类有很多种,其中生活节奏加快和工作压力的影响越显突出。不能生育严重影响着家庭的幸福和女性的身心健康。研究表明Rev-erbα对哺乳动物生物节律有重要的影响,但是人们对生物节律影响生殖的机制了解的还很少。而本研究以时钟基因Rev-erbα敲除型(Rev-erbα-/-)雌性小鼠为模型初步探索生物节律作用于生殖的机理。
目的: 本课题用不能生育的Rev-erbα-/-雌鼠为模型初步研究不能生育的原因及机制,以期为临床不孕不育的治疗与预防提供线索。本课题主要研究时钟基因Rev-erbα对雌性小鼠生殖的影响,进而探讨生物节律对小鼠生殖的影响。
方法:研究内容分以下几个方面:
1.确定Rev-erbα-/-雌性小鼠的生殖情况:利用Rev-erbα-/-雌性性成熟小鼠与C57BL/6J可育雄鼠交配,记录小鼠的生仔量,用Rev-erbα+/+雌性性成熟小鼠做对照。
2.组织切片比较Rev-erbα+/+与Rev-erbα-/-雌鼠卵巢的发育:取小鼠的卵巢组织经固定、脱水、石蜡包埋后切片、HE染色后显微镜下观察卵巢组织的结构和形态。连续石蜡切片后统计两基因型小鼠各级卵泡数量。
3.小鼠做超数排卵情况:利用超数排卵技术使21天左右的Rev-erbα-/-雌性发生超数排卵。取输卵管并在输卵管壶腹部取卵母细胞,收集并计数卵母细胞。
4.小鼠能否交配及能否形成早期胚胎
(1) Rev-erbα+/+雌鼠与Rev-erbα-/-雌鼠超数排卵交配后收集的胚胎统计;
(2) Rev-erbα+/+雌鼠与Rev-erbα-/-雌鼠自然状态下交配后收集的胚胎统计。
(1)为(2)的提示。
5.测定小鼠的生理周期及小鼠的激素周期:利用阴道涂片的方法来计算并比较Rev-erbα+/+和Rev-erbα-/-成年雌性小鼠的生理周期。用酶联免疫吸附实验(ELISA)测小鼠血清的激素水平。
6.测定小鼠卵巢中凋亡信号情况:用免疫组化或免疫荧光的方法,比较Rev-erbα+/+和Rev-erbα-/-卵巢种的凋亡信号。
7.小鼠胚胎的着床情况:用超数排卵的技术使成年雌鼠超排后交配或自然状态下交配,检栓,对见栓的小鼠4.5天后尾静脉注射染料观察着床点。
结果:实验结果显示Rev-erbα-/-雌性小鼠是不能生育后代的。在组织石蜡切片中Rev-erbα-/-雌性小鼠卵巢与Rev-erbα+/+的结构并无差异,即Rev-erbα-/-小鼠卵巢中存在正常的各级卵泡及生成的黄体结构。统计雌性小鼠卵巢中各级卵泡的数目发现:2月龄的小鼠没有差异。Rev-erbα-/-雌性小鼠做超数排卵实验发现能正常生成卵母细胞,且数量无明显差异。无论是自然状态还是超数排卵实验后都能交配并且能够生成早期胚胎,但早期胚胎数量明显降低,但是还不能确定Rev-erbα-/-雌性小鼠排出的卵泡结构和功能是否正常,以及形成的胚胎能不能在正常情况下发育成小鼠。在面对这样的一个表型又从另外三个方面研究Rev-erbα-/-雌性小鼠的不育情况,从实验结果来看:发现Rev-erbα-/-雌鼠的生理周期较Rev-erbα+/+的生理周期明显延长。雌孕激素周期无明显差异。做免疫荧光实验发现Rev-erbα-/-雌鼠凋亡信号(caspase3)较Rev-erbα+/+多。Rev-erbα-/-雌鼠交配见栓4.5天后,发现Rev-erbα-/-雌鼠着床率低。说明Rev-erbα缺失影响雌性小鼠胚胎着床。但是影响着床的因素(比如激素水平)很多,需要进一步研究。
结论:Rev-erbα-/-雌性小鼠能够生成卵母细胞,制约其不生育的可能是其他因素。Rev-erbα-/-雌性小鼠的生理周期较野生型小鼠明显延长。生物节律影响生理周期。Rev-erbα-/-雌性小鼠的胚胎形成及着床率低,说明Rev-erbα敲除从多方面影响雌鼠的生殖。
小鼠生育是一个复杂的过程,不仅与小鼠生理周期有关,还与小鼠的排卵及卵子的质量,受精,早期胚胎发育,输卵管中胚胎运输,胚胎着床,子宫蜕膜,胎盘,着床后胚胎发育等有关,以及体外环境多种因素影响小鼠最终产生后代。