论文部分内容阅读
白粉菌是一种活体营养型专性寄生病原菌，能够侵染小麦、大麦、大豆等多种作物，为农业生产带来巨大损失。因此，以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料，研究白粉菌抗病相关蛋白及其抗病机理能为农业生产和种质改良提供资源和理论指导。 EDR1(ENHANCED DISEASE RESISTANCE1)是拟南芥白粉菌抗病反应的负调控因子，在拟南芥免疫反应中发挥重要作用。之前的研究发现，EDR1通过与MKK4/MKK5直接相互作用负调控MKK4/MKK5-MPK3/MPK6的蛋白水平及MPK3/MPK6的激酶活性。为进一步解析EDR1调控MAPK信号通路进而调控植物抗病反应的分子机制，寻找可能参与EDR1信号通路的新组分，本研究一方面采用磷酸化质谱技术分析edr1突变体与野生型拟南芥中差异磷酸化蛋白，另一方面用EMS对edr1进行诱变，筛选抑制子，进一步通过遗传学、细胞生物学、生物化学及分子生物学等手段对相关基因进行功能分析。 通过磷酸化质谱分析本研究发现，KEG(KEEP ON GOING)在edr1突变体中存在特异的磷酸化位点。KEG是一个E3活性蛋白，通过泛素化途径参与底物蛋白降解。遗传学分析发现KEG的T-DNA插入功能缺失突变体keg-1和keg-2表现出增强的细胞死亡、更多的过氧化氢积累和PRs(PATHOGENESIS RELATED)基因的高表达。双分子荧光互补(BiFC)、蛋白质体外结合(Pull-Down)及酵母双杂交结果表明，KEG与MKK4/MKK5存在直接相互作用。体外泛素化体系检测发现，MKK4/MKK5是KEG的E3活性结构域RK(RING-KINASE)的泛素化底物。此外，在过表达MKK4/MKK5的拟南芥中检测到MKK4/MKK5的泛素化，且MKK4/MKK5降解依赖于26S蛋白酶体途径。这些结果说明EDR1对MKK4/MKK5蛋白水平的调控通过KEG介导的泛素化降解来完成。KEG通过泛素化降解MKK4/MKK5，负调控植物MAPK信号通路。同时，EDR1通过抑制KEG磷酸化来调控KEG的泛素化活性。 通过EMS诱变获得的edr1抑制子soed1-1(suppressor of edr1)表现出增强的白粉菌感病表型。soed1-1抑制edr1介导的白粉菌抗性、白粉菌诱导的细胞死亡及白粉菌或flg22处理后抗病相关基因的高表达和过氧化氢积累。 SOED1属于类受体蛋白家族，定位于质膜。SOED1的表达受白粉菌和flg22诱导。共表达EDR1能够抑制SOED1过表达引起的烟草叶片细胞死亡。烟草Co-IP结果显示，SOED1与共受体蛋白激酶BAK1(BRI1-ASSOCIATED KINASE1)和SOBIR1(SUPPRESSOR OF BIR1)处于同一个蛋白复合体中，而BAK1与下游胞质类受体激酶BSK1存在不依赖于flg22的蛋白相互作用。这些结果揭示类受体蛋白SOED1可能通过与共受体激酶BAK1和SOBIR1及下游BSK1形成免疫受体复合体在植物免疫反应中行使其功能。 综上所述，KEG与MKK4/MKK5互作，泛素化降解MKK4/MKK5。EDR1通过抑制KEG的磷酸化影响KEG的泛素化活性，从而调控MAPK信号通路，并进而调控植物的抗病反应。另外，类受体蛋白SOED1与共受体激酶BAK1和SOBIR1形成免疫受体复合体参与edr1介导的植物免疫反应。这些发现为进一步了解EDR1信号通路提供了新的理论基础和研究方向。