Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)通过介导天然免疫应答,产生免疫效应分子,对侵入机体的病毒进行清除,而病毒为了能够生存也会通过多种方式影响TLRs介导的免疫应答。目前,猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染过程中的免疫应答机制还不完全清楚,所以尚无法解释在感染的初期,CSFV逃避机体的天然免疫应答清除作用的机制。鉴于此,本研究以TLRs介导天然免疫信号通路为切入点,系统分析了猪瘟病毒对猪巨噬细胞TLRs及其信号通路关键蛋白和下游免疫效应分子表达的影响。在此基础上,在猪巨噬细胞中分别表达猪瘟病毒非结构蛋白,检测其对TLRs和免疫效应分子表达的影响,鉴定出具有明显作用的非结构蛋白(关键蛋白),明确关键蛋白调控免疫效应分子表达的信号转导通路,阐明猪瘟病毒非结构蛋白对猪巨噬细胞TLRs介导免疫应答的影响。获得了以下研究结果:(1)通过对比分析猪瘟病毒石门株和C株对猪单核细胞来源的巨噬细胞(p MDMs)TLRs及其信号通路关键蛋白和下游免疫效应分子表达的影响,发现CSFV使TLR2、TLR3、TLR4和TLR7的表达发生了显著性改变。具体表现为,CSFV石门株和C株感染均能显著上调TLR2、TLR4和TLR7的表达;而石门株显著下调TLR3。同时,在poly(I:C)的刺激下,CSFV石门株同样抑制了TLR3、TRIF、IRF3、IL-6和IFN-β的表达。综合分析CSFV影响TLR信号通路关键蛋白的活化和依赖于TLR的细胞因子应答结果表明,CSFV感染介导MAPKs活化,而未能激活NF-κB,从而影响促炎性细胞因子的分泌;与C株的感染相比,石门株对IRF3的表达起到有效地抑制作用,却能显著促进IRF7的活化,进而影响Ⅰ型IFNs的分泌。(2)首次揭示了在感染CSFV的组织中(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结)TLR2、TLR3、TLR4和TLR7的表达模式。结果显示,在感染CSFV石门株的各组织中,TLR2、TLR3、TLR4和TLR7的表达均发生显著变化。与对照组相比,感染组中TLR7的m RNA和蛋白水平均显著性上调;TLR2和TLR4的表达在肺脏和肾脏中显著性上调,而脾脏和淋巴结中均被抑制;TLR3的表达在淋巴结中明显减少。同时,免疫组化染色结果显示TLR2、TLR3、TLR4和TLR7不仅在巨噬细胞和淋巴细胞中表达,也在多种“非免疫细胞”中广泛表达,如心肌成纤维细胞、平滑肌细胞以及支气管和肾小管上皮细胞。TLRs在各种组织细胞的差异表达分析有助于探究机体天然免疫系统对猪瘟病毒的免疫识别机制。(3)通过慢病毒包装系统介导CSFV非结构蛋白Npro、NS2、NS3、NS3/4A、NS4B、NS5A和NS5B过表达于猪肺泡巨噬细胞,研究非结构蛋白对TLR信号通路的影响。结果表明,Npro蛋白能够下调TLR2的表达而上调TLR4的表达;NS2可促进TLR2、TLR4和TLR7的高表达;NS3、NS3/4A、NS4B、NS5A均显著下调TLR3的表达。再者,Npro、NS2、NS3、NS3/4A、NS4B和NS5A均未能引起NF-κB p65的磷酸化;NS3、NS3/4A、NS4B和NS5A均能显著下调TRIF和IRF3的表达,并且抑制IL-6和IFN-β的分泌。进一步利用TLR3的配体poly(I:C)刺激稳定表达NS3、NS3/4A、NS4B和NS5A的巨噬细胞系发现,与空载体对照相比,NS3、NS3/4A、NS4B和NS5A同样抑制了TLR3、TRIF、IRF3、IL-6和IFN-β的转录表达。初步鉴定出具有明显作用的非结构蛋白(关键蛋白),明确了关键蛋白调控免疫效应分子表达的信号转导通路。(4)成功构建了稳定表达Npro、NS2、NS3、NS3/4A、NS4B、NS5A和NS5B的巨噬细胞系,为后期研究非结构蛋白与TLR信号通路中关键蛋白的相互作用和共定位以及阐明CSFV调控TLRs介导的天然免疫应答机制提供了物质基础。综上所述,本研究开展了CSFV及其非结构蛋白对TLRs介导天然免疫反应影响的初步研究,探究了CSFV及其非结构蛋白作用于哪些TLRs以及TLRs信号通路中的哪些关键位点而起到调节免疫应答这一根本问题,同时也揭示了TLRs在CSFV感染组织中的表达模式,初步建立了CSFV非结构蛋白对猪巨噬细胞TLRs介导天然免疫应答机制研究的平台。