‘世纪无核梨’生物学特性及其调控基因发掘

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wangzhanglu
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近年来,关于果实无籽方面的报道越来越多,而在梨上的研究报道并不多见。本研究对‘世纪无核梨’品种进行了果实无籽率的调查统计,并以‘世纪无核梨’以及其亲本‘巴梨’和‘鸭梨’为试材,研究了三者在形态解剖学、激素含量以及生殖器官上的异同,确定了‘世纪无核梨’种子败育的关键时期,从转录水平上以其亲本‘巴梨’和‘鸭梨’为对照,分析了‘世纪无核梨’种子败育过程中的差异表达基因,并成功克隆了其中的两个关键基因,且构建了超表达载体,为进一步从分子水平深入研究种子败育现象提供基础,也为蔷薇科其它无籽水果的选育提供一定的基因资源。主要结果如下:1.为了解‘世纪无核梨’种子败育发生情况,本研究对其果实的种子败育率进行调查统计,并通过SRAP分子标记鉴定了其亲本,结果表明‘世纪无核梨’无籽率达100%,仅有核的形状,但是无籽,可全部食用;‘巴梨’与‘鸭梨’为‘世纪无核梨’的亲本。为探讨‘世纪无核梨’种子败育的原因,设置了一系列授粉、观察花柱和胚珠发育的试验,结果表明:‘世纪无核梨’种子败育来源于雌性器官,但该品种在生产过程中需要配置授粉品种才能保证它的坐果率。此外通过与其亲本正常有籽梨‘巴梨’和‘鸭梨’的形态解剖结构的观察比较发现:授粉后8d是‘世纪无核梨’果实胚珠开始发生败育的关键时期,与正常亲本比较,胚珠颜色开始变黑,体积开始缩小;授粉12d后胚珠完全变黑变瘪,此时完全败育。选取幼果时期‘世纪无核梨’与其亲本的果肉,并对这些样品的激素含量进行测定,结果发现,与其亲本相比,‘世纪无核梨’果肉中有较高含量的生长素及赤霉素类物质,这是导致其种子败育的原因之一,此外在种子中也可以产生促进果实发育的激素,‘世纪无核梨’果肉中较高含量的生长素及赤霉素类物质弥补了该品种无籽的缺陷,保证了其果实的正常发育。2.为深入探究无籽品种‘世纪无核梨’与其亲本有籽品种‘巴梨’、‘鸭梨’在转录水平上的差异,以‘世纪无核梨’种子发生败育关键时期以及败育前后共三个时期的胚珠组织为试验材料,并以‘巴梨’、‘鸭梨’同时期的材料作为对照,对无籽梨和有籽梨进行转录组研究,并对测序结果进行分析。共18个样品,使用HiSeq 2000测序平台进行测序获得 26,658,800-39,250,026 的clean reads,79.81%-93.35%的 clean reads可以唯一地比对到参考基因组(‘砀山酥梨’和‘巴梨’)。在获得的差异表达基因中,将与种子成熟、胚胎发生和激素信号转导相关基因作为参与种子败育反应的候选基因。我们推测MYB,bHLH,WRKY和NAC等有显著差异表达的转录因子家族在种子败育过程中也起重要作用,并重点分析了 MYB和bHLH转录因子的相互作用。KEGG富集分析发现差异基因多数富集在与脂质代谢和碳水化合物代谢的途径。为验证转录组测序结果的真实可靠性,本研究采用qRT-PCR方法,随机选择了 14个差异表达的基因进行检测,其qRT-PCR的结果与转录组中的表达丰度的变化基本一致。以上结果为进一步揭示‘世纪无核梨’种子败育现象的分子机理奠定了基础,也给蔷薇科其它无籽果实的分子育种提供了一定的基因资源。3.通过RNA-seq以及qRT-PCR结果,我们对一系列具有显著差异表达的候选基因进行克隆并构建表达载体,以期通过转基因试验验证这些基因是否影响种子异常发育。目前在RNA-seq测序结果及qRT-PCR中均有显著上调表达的两个关键基因PbrMYB108(Pbr038922.1)和PbrWRKY75(Pbr042883.1)已克隆并成功构建过表达载体。这为后续验证这两个转录因子是否调控‘世纪无核梨’种子的发育提供一定的基础。
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