肺炎支原体是人呼吸道感染中重要的病原微生物之一，流行病学及一些临床研究，表明呼吸道肺炎支原体感染同哮喘的发作关系密切。肺炎支原体感染可以诱发哮喘发作或使得慢性哮喘持续存在。支气管哮喘（简称哮喘）是以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、中性粒细胞等多种细胞和细胞组分参与的一种慢性气道炎症性疾病。近年来在儿童中发病率逐年升高。哮喘的发作同多种因素有关，例如接触致敏原，吸入冷空气，呼吸道感染等等。其中呼吸道感染同哮喘的发作关系极为密切。在哮喘患者的气道中分离出肺炎支原体的比例要远远高于健康人。那些感染了肺炎支原体的哮喘患者使用大环内酯类的药物能够改善肺功能。肺炎支原体感染可以诱发哮喘发作或使得慢性哮喘持续存在的原因是多方面的，涉及到气道炎症和IgE介导的气道高反应性等复杂的相互作用，还涉及到患儿的个体特征，如易感体质等。还有研究报道， MP感染小鼠呼吸道后，能导致以气道高反应性、气道阻塞和气道组织学炎症为特征的慢性肺部疾病，该研究结果提供了较强的证据支持MP感染与慢性肺疾病相关的假说，比如在人类的哮喘。目前研究发现肺炎支原体可以通过定植于呼吸道的上皮细胞，刺激多种细胞包括上皮细胞、肥大细胞、巨噬细胞释放大量的炎性因子，导致气道高反应和气道慢性炎症。而哮喘的发病机制亦是复杂的，其核心是气道高反应和气道的慢性炎症。二者具有共同的病理生理过程。此外，哮喘的气道反应性和慢性炎症均明显增加，气道的慢性炎症使哮喘对MP易感性改变。不少研究都显示了MP感染与哮喘恶化间的密切性:有20-25％的哮喘儿童感染MP后出现了哮喘的急性恶化;MP感染可能激发变态反应的敏感性，增加哮喘气道的炎症反应;MP感染可诱发哮喘、使哮喘恶化或使哮喘难以控制。随着对哮喘的进一步研究，哮喘的神经机制日益受到重视。目前认为由肺内感觉神经末稍释放的神经肽所介导的神经源性炎症在哮喘发病机制中起到重要作用。　　 目前研究认为，气道的神经调节除了经典的胆碱能和肾上腺素能神经系统外，还存在一种称为非肾上腺素能，非胆碱能(NANC)神经系统。NANC神经分为非肾上腺素能、非胆碱能的抑制神经(NANCi)和兴奋神经(NANCe)，前者兴奋具有舒张平滑肌的作用，其递质是血管活性肠肽(VIP)及一氧化氮(NO);而后者受到刺激后具有强烈的收缩气道平滑肌之效应。现认为非肾上腺素非碱胆能兴奋性神经通道是由无髓鞘传入迷走神经纤维构成，其递质是感觉神经肽。　　 目前认为与哮喘关系较为密切且研究较多的感觉神经肽有神经激肽A(NKA)，神经激肽B(NKB)，P物质，又由于三者有迅速收缩气道平滑肌之作用，故又称为速激肽。他们主要通过引起平滑肌收缩，增加血浆外渗，促进黏液高分泌及促进炎症介质释放等作用参与哮喘的病理生理过程。研究认为NKA是重要的感觉神经肽之一，是哮喘患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中主要的速激肽，浓度很高，且在抗原激发后显著增高。NKA是在三者中收缩气道平滑肌的作用最强，这可能同NKA免疫反应神经在支气管平滑肌有很广泛的分布有关，同时NKA也有增加气道微血管渗出及粘液分泌的作用。此外，另外两种速激肽SP主要分布在血管周围，以增加气道微血管渗出，促进粘液分泌作用为主;NKB同NKA分布及作用相似，但收缩平滑肌作用较NKA明显减弱，尚云晓等研究已证实小儿哮喘发作期血中NKA含量明显增高，病情愈重增高越明显，随哮喘症状缓解血中NKA含量下降至正常水平，血中NKA含量的变化与小儿哮喘的发作及缓解关系密切。随着人们对哮喘神经机制认识的日益加深，人们发现NKA、SP、NKB并非直接发挥作用，而是通过特异的细胞受体而发挥生物活性。目前主要3种感觉神经肽受体亚型被鉴定出，即NK1、NK2和NK3受体。其中，NKA主要通过NK2受体而生物学活性，目前在哮喘的神经机制中NK2受体被认为是最重要的受体之一，同哮喘气道高反应的形成关系密切。此外NK1受体主要由于SP激活，NK3受体主要由NKB激活。三者均属于G蛋白耦联受体家族成员，各自由一条7次穿膜的肽链构成。速激肽同其相应受体特异性结合后，Gp蛋白被激活，随之由第二信使三磷酸肌醇(IP3)，钙离子-钙调蛋白酶途径导致平滑肌收缩，气道周围微血管扩张，增加血浆外渗，促进粘液高分泌及促进炎症介质释放等。目前认为速激肽受体及相关配体通过上述反应参与哮喘的病理生理过程。气道高反应性是哮喘的基本特征，气道慢性（变应性）炎症是哮喘的基本病变，在肺炎支原体感染后我们也看到了类似的呼吸道变化。人的支气管内膜活检发现，肺炎支原体检测阳性的哮喘患者其NK1受体的mRNA同肺炎支原体检测阴性的哮喘患者相比，明显上升。Mp感染制作的动物模型研究在国内较少，仅有数篇研究，而且均为使用大鼠进行模型制作，MP感染BALB/c小鼠国内尚无相关报道，此外对于同时给予MP和卵蛋白致敏干预的模型仍无相关报道。国际公认BALB/c作为MP感染的动物，但是MP培养困难，周期长，不易存活，因此MP感染的模型制作比较困难。本研究建立起MP感染BALB/c小鼠的模型，进行了MP感染BALB/c小鼠的研究，本实验通过ELLSA、Real-time PCR、Western等方法，一方面研究了单纯MP感染后不同时间点小鼠的气道阻力、肺泡灌洗液中细胞因子的含量、NK1、NK2受体在肺组织中的表达;另一方面研究了在给予卵蛋白致敏BALB/c前后分别感染MP小鼠的气道阻力、肺泡灌洗液中细胞因子的含量、NK1、NK2受体在肺组织中的表达。成功建立MP感染BALB/c小鼠的模型，对后续实验的开展起到了奠基的作用。了解NK1-R和NK2-R是否参与了肺炎支原体诱发哮喘和使哮喘加重的机制。　　 材料与方法:　　 1.BALB/c小鼠肺炎支原体感染小鼠模型的制作　　 选用生后4周龄BALB/c小鼠，雌雄各半，随机分为肺炎支原体感染组和正常对照组。置于SPF级清洁动物室，在标准条件下分笼饲养。10％水合氯醛0.05ml/只腹腔注射麻醉BALB/c小鼠，感染组每只BALB/c小鼠滴鼻接种浓度为108ccu/mlMP菌液0.02ml，将小鼠头后仰30-45℃，随小鼠的自然呼吸动作，MP菌液到达下呼吸道。正常对照组以PBS代替肺炎支原体给小鼠滴鼻接种。　　 2.小鼠哮喘模型的制作　　 实验第1天，哮喘组小鼠腹腔注射20μg卵蛋白(ovalbumin，OVA)和2mg氢氧化铝混合于0.5ml磷酸盐缓冲液(PBS)中;实验第8，15，22天，腹腔注射10μg OVA和1mg氢氧化铝混合于0.5ml磷酸盐缓冲液(PBS)中;实验第23天开始，给予4％ OVA（PBS配制）雾化吸入，每天一次，每次25-30分钟至喘息发作，连续7天。PBS对照组以PBS代替OVA腹腔注射及雾化吸入，其余均与哮喘组相同。　　 3.分组和标本采集　　 选择同种属、同体重(14g～16g)、饲养条件一致的BALB/c小鼠，雌雄各半、随机分成以下各组。按不同的时间点及处理因素进行分别研究。　　 感染3天组(MP3):感染MP后3天取材　　 感染7天组(MP7):感染MP后7天取材　　 感染14天组(MP14):感染MP后14天取材　　 感染21天组(MP21):感染MP后21天取材　　 感染30天组(MP30):感染MP后30天取材　　 MP+OVA:感染MP后3天后按照制作哮喘模型给予OVA致敏及诱发喘息，最后一次雾化吸入后24小时取材　　 MP+PBS组:同MP+OVA组同时感染MP,感染MP后3天，给予PBS致敏及诱发喘息，同MP+OVA同时取材　　 OVA+MP:按照制作哮喘模型给予OVA致敏及诱发喘息后第二天给予鼻腔滴入MP，给予MP后3天取材　　 PBS+MP:按照制作哮喘模型给予PBS致敏及诱发喘息后第二天给予鼻腔滴入MP，给予MP后3天取材　　 4.支气管及肺组织病理学检测:HE染色检测MP感染和哮喘的病理变化;免疫组化图像分析检测NK-1R、NK-2R表达组间差异。　　 5.ELLSA检测支气管肺泡灌洗液中IgE、IFN-γ、 IL-4、IL-5、IL-10的含量　　 6.检测各组小鼠的吸气阻力、呼气阻力、顺应性。　　 7.Real-time PCR检测各组肺组织NK-1RmRNA、NK-2RmRNA表达差异。　　 8.Western-blot检测各组各组肺组织NK-1R蛋白、NK-2R蛋白表达差异。　　 结果:　　 1.MP感染后第3、7、14、21天的肺指数均高于对照组;用PCR的方法检测支气管肺泡灌洗液MP-DNA，第7天阳性率最高，达到100％阳性;MP感染后第3、7炎症明显，第14天开始消退，第21天基本接近正常。　　 2.MP感染后第3、7、14、21、30天，小鼠支气管肺泡灌洗液中IgE、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10含量升高（感染组同对照组相比，p＜0.05，差异有统计学意义）。OVA+MP组同OVA+PBS组BALF中IgE、IFN-γ、 IL-4、IL-5、IL-10的含量相比较，p＜0.05，统计学有显著差异。MP+OVA组同MP+PBS组BALF中IgE、IL-4、IL-5、IL-10的含量相比较，p＞0.05，差异无统计学意义;BALF中IFN-γ在MP+OVA组同MP+PBS之间有差异，p＜0.05。　　 3.MP感染后第3天、第7天、第14天、第21天、第30天各测量点之间的RI、RE、Cydn，P＜0.05，差异有统计学意义。OVA+MP组同OVA+PBS组相比，气道吸气阻力、呼气阻力增加，p＜0.05，差异有统计学意义;肺顺应性没有差异，p＞0.05。MP+OVA组与MP+PBS组RI、RE、Cydn相比较，p＞0.05，差异无统计学意义。　　 4.NK1-R、NK2-R主要分布于气管上皮细胞上层细胞表面、粘膜下层、血管周围上皮细胞、炎症细胞的表面和平滑肌细胞、腺体细胞表面。于光镜下观察可看到哮喘组、OVA+MP、MP+OVA组气管及肺组织中可见明显的棕黄色表达，表达程度明显高于正常对照组;OVA+MP组的表达强于哮喘组，MP+OVA组同哮喘组表达强度大致相同;正常对照组仅于气管上皮细胞及粘膜下层呈微弱着色.　　 5.在MP感染后NK1-R、NK2-R在支气管上皮细胞上层细胞表面、粘膜下层、肺泡上皮细胞，平滑肌周围的表达，感染组较对照组相比，p＜0.05，差异有统计学意义。OVA+MP组同OVA+PBS和PBS组NK1-R、NK2-R的光密度相对含量相比，p＜0.05，差异有统计学意义。MP+OVA组和MP+PBS组相比，NK1-R、NK2-R的光密度相对含量相比，p＜0.05，差异有统计学意义。　　 6.在MP感染后，NK-1RmRNA第3天较正常对照组略有下降，第7天较正常对照组升高，第14天较正常对照组下降，第21天正常对照组下降，第30天较正常对照组升高。NK-1RmRNA在OVA+MP组的表达较OVA+PBS组减低。NK-1RmRNA在MP+OVA组的表达较MP+PBS组减低。在MP感染后，NK-2RmRNA在BALB/c小鼠肺组织的表达，第3天较正常对照组升高，第7天较正常对照组升高更加明显，第14天较正常对照组大体相同，第21天较正常对照组升高，第30天较正常对照组升高。NK-2RmRNA在OVA+MP组的表达较OVA+PBS组减低。NK-2RmRNA在MP+OVA组的表达较MP+PBS组升高　　 7.在MP感染后，NK-1R蛋白第3天较正常对照组表达强度减弱，第7天较正常对照组表达强度增加，第14天较正常对照组强度减弱，第21天较正常对照组表达强度减弱，NK-1R蛋白在OVA+MP组较OVA+PBS组的表达表达强度明显增强。在MP感染后，NK-2R蛋白第3天较正常对照组表达强度略增加，第7天较正常对照组表达强度增加，第14天较正常对照组表达强度增加，第21天较正常对照组表达强度增加，第30天较正常对照组表达强度增加。NK-2R蛋白在OVA+MP组较OVA+PBS组的表达强度明显增强。NK-2R蛋白在MP+OVA组的表达较MP+PBS表达强度明显增强。　　 结论:　　 1.MP感染BALB/c小鼠后可引起支气管肺泡灌洗液IgE、IL-4、IL-5、IL-10的含量升高，引起气道反应性增加，呼气阻力和吸气阻力都增加。对致敏的小鼠增加其支气管肺泡灌洗液IgE、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10的含量，使其气道反应性增加，放大炎症作用。致敏前感染MP，不增加其支气管肺泡灌洗液IgE、IL-4、IL-5、IL-10的含量，不加重气道反应性。有一定预防作用。　　 3.MP感染BALB/c小鼠后可引起气管、支气管和肺组织NK1-R、NK2-R表达增强，无论在致敏前后感染MP均可使BALB/c小鼠NK1-R、NK2-R表达增强，肺炎支原体感染可以通过上调NK1-R、NK2-R诱发喘息的发作和加重哮喘的恶化。