COPD是慢性气道疾病,与有毒颗粒和气体引起的肺组织异常炎性反应有关,导致气流受限不完全可逆的肺气肿。COPD是全世界死亡率的第5位因素,而且COPD的患病率和死亡率有逐年上升的趋势。目前对COPD发病机制的观点是香烟刺激物诱导炎性细胞的聚集,炎性细胞释放活性氧和蛋白水解酶,引起肺基质的毁损和结构细胞的死亡。最近的研究认为肺组织结构细胞的凋亡可能在COPD的发病机制中有很重要的作用。对COPD病人肺组织切片的研究发现肺泡上皮细胞和内皮细胞的凋亡增加,而这些结构细胞的增殖并没有均衡的增加,因而可促进肺组织的毁损和肺气肿的发生。而且在严重的COPD动物模型中发现,在肺气肿的发展中显著缺乏炎性细胞。动物实验证明即使没有炎性细胞的聚集,肺泡壁细胞或内皮细胞凋亡也足够引起肺气肿的发生。越来越多的证据证明了炎症、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化应激与凋亡相互作用导致COPD发病的复杂性。因此有待于进一步研究在COPD发病过程中凋亡的途径,以及进一步评估是否抗凋亡或再生可以成为阻止疾病进一步恶化的靶点。在健康肺组织的毁损过程中凋亡和再生失衡现象也提示应用干细胞治疗肺气肿疾病的可能。最近干细胞的研究使组织损伤和再生的传统治疗观点带来了新的希望。实验发现骨髓间充质干细胞(MSCs)有迅速增殖的潜能,MSCs来源的细胞可以分化为间充质组织,例如骨、软骨、肌肉以及非间充质组织,如内皮细胞、肝细胞、神经细胞。心血管系统和神经系统学科在干细胞的研究中有很大的突破,但是由于呼吸系统结构和功能的复杂性,呼吸干细胞的研究发展很慢。Ortiz报道了骨髓来源干细胞可能减轻博来霉素诱导的肺纤维化,第一次提出骨髓来源的干细胞对肺组织疾病具有显著效果。近年来关于干细胞对肺损伤的研究逐渐开展起来,争议众多,焦点在于MSCs是否对损伤肺组织有修复作用以及分化为哪种类型的肺组织细胞。骨髓干细胞在肺内分化能力和作用的报道各异。Hashimoto移植表达EGFP的MSC/HSC到博来霉素诱导的肺纤维化小鼠,引起大量的GFP阳性细胞迁移到达纤维变性的损伤区,提示许多成纤维细胞来源于骨髓来源的前体细胞。Mauricio Rojas应用博来霉素和白消安处理的肺损伤模型,在GFP- MSCs移植后,发现肺内GFP阳性细胞可以分化为I型肺泡上皮细胞、II型肺泡上皮细胞、成纤维细胞、肌纤维母细胞和内皮细胞。但是由于试验方法和技术的不同,如骨髓干细胞的提取、肺损伤的方法、移植物在组织中的检测方法不同,众多实验小组的研究结果不同,检测到HSC/MSC在肺内分化为不同类型的细胞。目前肺损伤后移植干细胞的量、时机以及干细胞在肺内的修复作用还没有明确的肯定。骨髓MSCs不仅具有分化能力还有分泌功能,能够分泌多种细胞因子例如白介素(IL)-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15以及白血病抑制因子(LIF)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)等。Chen等报道通过尾静脉注射骨髓基质细胞到脑缺血大鼠,可以促进成纤维细胞生长因子的表达,减少脑缺血部位细胞的凋亡,改善脑缺血大鼠的脑功能恢复。Kocher等报道移植造血干细胞可改善心肌梗死周边区肥大心肌细胞的凋亡。因此提出干细胞不仅具有分化作用,也可以通过一些途径抑制损伤部位细胞凋亡的发生。MSCs移植对肺气肿是否有修复作用,在肺内可以分化为哪种类型的结构细胞,在肺组织微循环的作用下分泌哪些细胞因子,是否也同样具有抗细胞凋亡作用,抗凋亡的途径是什么,目前还鲜见报道。因此我们应用MSCs移植到木瓜蛋白酶和钴60照射诱导的肺气肿模型中,探讨肺气肿形成的机制以及MSCs移植对肺损伤修复作用的机制,为干细胞治疗肺气肿疾病的可能提供实验依据。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞体外分化能力的鉴定目的:建立体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,观察MSCs的生物学性状,为进一步研究提供实验依据。方法:取2月龄大鼠骨髓,经密度梯度离心后取单个核细胞层接种,保留贴壁细胞传代,观察细胞生长情况,测定生长曲线,流式细胞仪进行MSCs表型测定和细胞周期分析。检测细胞向成骨、成脂细胞分化情况。结果:从大鼠骨髓中培养的MSCs具有体外扩增和多向分化潜能。结论:建立了体外分离纯化MSCs的方法,验证了MSCs体外分化潜能,可作为组织工程种子细胞的可行性。第二部分放射损伤对于移植的骨髓间充质干细胞在受体大鼠不同器官中植入的影响目的:探讨放射损伤对于骨髓间充质干细胞(MSCs)移植后在受体大鼠不同器官中植入的影响以及可能的机制。方法:采用TUNEL法检测正常对照组和单纯放射组大鼠心脏、肾脏、肝脏、肺脏的细胞凋亡率。应用密度梯度离心法结合贴壁法提取雄性大鼠骨髓MSCs,培养后把MSCs移植到60COγ照射和未经照射的雌性大鼠体内,通过PCR和Y染色体荧光原位杂交(Y- FISH)示踪雄性大鼠MSCs在雌性大鼠体内的分布情况。结果:照射后大鼠心脏、肾脏、肝脏、肺脏细胞凋亡率显著高于对照组。PCR结果显示照射后移植MSCs的大鼠心脏、肾脏、肝脏、肺脏和外周血中可以扩增出Sry基因的DNA序列,而且Y- FISH显示照射后移植MSCs的大鼠在心脏、肾脏、肝脏、肺脏中可发现Y染色体阳性的细胞。但是未经照射行MSCs移植的大鼠在上述器官中未发现Y染色体阳性的细胞。结论:全身放射促进组织细胞的凋亡,并导致移植的MSCs在受体大鼠心脏、肾脏、肝脏和肺脏的植入。第三部分肺泡壁细胞的凋亡参与木瓜蛋白酶所致大鼠肺气肿的形成目的:观察木瓜蛋白酶所致的肺气肿大鼠肺泡壁细胞凋亡,探讨细胞凋亡在肺气肿发病中的作用。方法:大鼠随机分为3组:正常对照组,木瓜蛋白酶组,木瓜蛋白酶和钴60处理组。观察肺组织病理学变化,TUNEL法检测大鼠肺泡壁凋亡细胞,免疫组化法检测肺泡壁细胞PCNA、Bax和SP-C蛋白的表达。TUNEL与SP-C免疫荧光法鉴定凋亡细胞中的II型肺泡上皮细胞。结果:木瓜蛋白酶组、木瓜蛋白酶和钴60处理组大鼠出现明显肺气肿改变。木瓜蛋白酶和钴60处理组平均内衬间隔、平均肺泡面积和单位面积肺泡数与木瓜蛋白酶组比较有显著性差异。木瓜蛋白酶组、木瓜蛋白酶和钴60处理组大鼠肺泡壁细胞的AI、PI以及Bax染色阳性的细胞百分比显著高于正常对照组;而SP-C染色阳性的细胞百分比显著低于正常对照组。木瓜蛋白酶和钴60处理组大鼠的AI、PI、Bax染色阳性的细胞百分比显著高于木瓜蛋白酶组;而SP-C染色阳性的细胞百分比显著低于木瓜蛋白酶组。肺气肿改变组中一些TUNEL阳性细胞表达II型肺泡上皮细胞标志SP-C。结论:大鼠肺泡壁细胞特别是II型肺泡上皮细胞凋亡参与肺气肿的形成,Bax蛋白的表达上调可能是导致肺气肿大鼠肺泡壁细胞的凋亡的原因之一。第四部分骨髓间充质干细胞移植改善木瓜蛋白酶和钴60照射所致的大鼠肺气肿改变目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞移植对木瓜蛋白酶和钴60照射所致的肺气肿大鼠肺泡壁细胞的凋亡以及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响,骨髓MSCs移植后在受体肺组织中的植入和分化情况,探讨骨髓MSCs移植改善木瓜蛋白酶和钴60照射所致肺气肿的机制。方法:雌性大鼠随机平均分为三组:正常对照组、肺气肿组、肺气肿+MSCs移植组。利用木瓜蛋白酶气管内滴入和钴60照射诱导雌性大鼠肺气肿模型的建立,然后将培养的雄性大鼠MSCs经尾静脉注射到雌性肺气肿大鼠。观察移植28d后肺组织形态学变化,采用TUNEL法检测肺泡壁细胞的凋亡,免疫组化法检测Bcl-2蛋白、Bax蛋白在肺泡壁细胞中的表达。通过PCR和Y染色体荧光原位杂交(Y- FISH)示踪雄性大鼠MSCs在雌性肺气肿大鼠肺组织内的植入情况;用Y-FISH和肺泡表面活性物质蛋白C(SP-C)免疫荧光显色方法检测雄性大鼠MSCs在受体肺组织内是否分化为II型肺泡上皮细胞。结果:肺气肿组、肺气肿+MSCs移植组大鼠出现肺气肿改变,但肺气肿+MSCs移植组大鼠肺组织的肺气肿改变较肺气肿组减轻;肺气肿组平均内衬间隔、平均肺泡面积和单位面积肺泡数与肺气肿+MSCs移植组比较有显著性差异;TUNEL结果显示肺泡壁细胞凋亡指数在肺气肿组和肺气肿+MSCs移植组大鼠明显高于正常对照组,肺气肿+MSCs移植组肺泡壁细胞凋亡指数明显低于肺气肿组(P<0.01);免疫组化结果显示肺气肿+MSCs移植组Bcl-2染色阳性细胞百分比高于肺气肿组(P<0.01),肺气肿+MSCs移植组Bax染色阳性细胞百分比明显低于肺气肿组(P<0.01),肺气肿+MSCs移植组Bcl-2/Bax比值高于肺气肿组。PCR结果显示肺气肿+MSCs移植组的大鼠肺脏基因组DNA中可以扩增出位于Y染色体的Sry基因片断;Y-FISH显示肺气肿+MSCs移植组的雌性大鼠肺组织中有Y染色体阳性的细胞;Y-FISH和SP-C荧光免疫组化结果显示肺气肿+MSCs移植组的雌性大鼠肺组织中的部分Y染色体阳性细胞同时表达SP-C。结论:骨髓MSCs移植能够减轻木瓜蛋白酶和钴60照射所致肺气肿改变,可能与骨髓MSCs移植抑制肺气肿大鼠肺泡壁细胞的凋亡,移植的MSCs在受体肺组织中的植入和分化为II型肺泡上皮细胞有关。