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杆状病毒是有囊膜的双链闭合环状DNA大形病毒,其基因组大小为80-180 kb,主要以鳞翅目昆虫为宿主,迄今仅从节肢动物(绝大部分为昆虫)中分离出来,而且都具有高度的宿主特异性。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrosis virus,AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NPV,BmNPV)是杆状病毒的2个典型代表,2种病毒整个基因组核苷酸序列的同源性约为70%,而保守基因间的同源性则在90%以上。尽管二者的关系很近,其天然宿主域却不同,它们之间没有共同的宿主。然而,无论AcMNPV还是BmNPV,只要部分序列的更变,就能造成宿主域的扩展。为了解病毒的感染机制,分别构建了携带红色荧光蛋白(red fluorescent protein,rfp)基因和绿色荧光蛋白基因的重组病毒,分离了具有特殊感染性的野蚕核型多角体病毒,进行了相关的研究,获得了如下的结果:
1.将rfp基因重组到家蚕杆状病毒中,获得了感染后能产生红色荧光的重组病毒Bm-rfp。病毒产生的荧光较强烈,表明rfp基因的表达量较高,可用于昆虫病毒感染的观察或融合表达蛋白的示踪实验。
2.将重组病毒Bm-rfp和Bm-gfp同时感染家蚕细胞时,感染的细胞48小时后呈现出荧光。但几乎是单色荧光,而混合的荧光很少观察到。同样,在感染家蚕幼虫的实验中也观察到,红色荧光和绿色荧光分别出现在不同的组织中。说明单个家蚕细胞融合病毒的数目非常少,大多的细胞只能融合1次。
3.用Bm-rfp或Bm-gfp单独感染SF21细胞,几乎观察不到荧光的产生。但以Bm-rfp或Bm-gfp与AcMNPV病毒混合后,在较多的SF21细胞中观察到荧光。表明AcMNPV的病毒粒子与BmNPV的病毒进入细胞的位点可能不在同一位置,而在混合感染的细胞中,多角体的数目较少,说明病毒的混合感染影响多角体的形成。为了解Bm-rfp及Bm-gfp是否在SF21细胞中增殖,取微量(5μL)的混合感染液再感染SF21细胞,3d后观察,发荧光的细胞数明显增加,表明家蚕的重组病毒在SF21中得到了扩增。
4.克隆了AcMNPV的heli基因片段,并以之与BmNPV DNA转染Tn5及BmN细胞,经多次重复转染实验和病毒在细胞间穿梭感染,均未获得既可以感染BmN细胞也能感染Tn5细胞的病毒株。结果表明,BmNPV感染Tn5或Sf细胞的机制并不与AcMNPV扩展感染BmN细胞的相同,可能还涉及到其他基因。
5.从野桑蚕核型多角体病毒(BmmNPV)中分离纯化出一株在形态上出现差异病毒S1株BmmNPVS1,以该病毒和BmNPV及AcMNPV感染BmN,Tn5和SF21细胞,分析其感染状况。结果表明,该病毒在感染力方面介于BmNPV和AcMNPV之间,进一步通过DNA的酶切片段对其DNA进行比较分析。对3种DNA的酶切结果表明,BmmNPVSl的DNA带型更接近于BmNPV。
6.用BmmNPVS1与BmNPV-GFP病毒感染Tn5和SF21细胞。结果表明,BmmNPVS1可以促进BmNPV-GFP病毒的感染,在较多的细胞中观察到荧光的出现。扩增出BmmNPVS1 helicase与BmmNPVS1、BmNPV和AcMNPV helicas进行比对,通过分析表明BmmNPV S1与BmNPV的同源关系较近,与宿主域有关的位点保持一致,而与AcMNPV的同源关系相对较远,在与宿主域有关的位点并没发生突变。
综上所述,分析了新分离的病毒BmmNPVS1,其宿主域扩展的机制不同于AcMNPV;杆状病毒的感染方式有特异性,同种病毒很难感染同一个细胞,其机制有待深入分析。