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为制备高活性的抗氧化肽,本研究以林蛙油作为底物,用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶分别在各个酶最适条件下进行酶解,以所得多肽清除羟自由基能力大小为指标,制备林蛙油小分子抗氧化肽。同时,也测定了木瓜蛋白酶和中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶、中性和胰蛋白酶三种复合酶所制备的小分子肽清除羟自由基(·OH)的能力、清除超氧阴离子(O2-·)的能力、清除DPPH·自由基的能力。经过筛选,中性蛋白酶酶解林蛙油所得多肽的抗氧化活性最高,因此采用中性蛋白酶作为本研究中实验用酶,并获得以下主要结果：利用单因素试验考察了加酶量、水解温度、pH值和酶解时间对底物的清除羟自由基活性的影响,并筛选出对其影响显著的因素进行Box-Behnken中心组合设计和响应面分析,对酶解反应的主要影响因素进行多项式回归模型建立和最优化,确定了中性蛋白酶酶解底物的最佳工艺条件为：温度50℃,pH值7.5,酶用量(E/S)为2%(m/v),酶水解时间10.0h,得到多肽对羟自由基的清除率为42.75%,与模型最优化理论值相差为0.07%。通过对比优化前后所得多肽的抗氧化活性,发现优化酶解条件后,林蛙油多肽清除羟自由基的能力、清除超氧阴离子的能力、清除DPPH-自由基的能力都有所提高,其中清除清除羟自由基的能力提高比较显著,优化后清除羟自由基的IC50降至27.35mg/mL,比优化之前降低了12.56mg/mL,而优化后的多肽对DPPH的清除率的IC50从优化前的12.39mg/mL降为优化后的11.68mg/mL,对超氧阴离子的清除率的IC50由优化前的22.32mg/mL降至19.17mg/mL,差异不明显。酶解液经超滤初步分离,得到分子量分别<5k、5-10k、10k-30k、>30kDa的四个组分,比较四个组分的抗氧化活性,选取活性最高的组分,即分子量5-10kDa的组分进行SephadexG-50凝胶柱分离纯化,分离得到4个组分,发现组分Ⅰ、Ⅲ的抗氧化活性最高。