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血蓝蛋白是节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜输氧蛋白。软体动物血蓝蛋白与节肢动物血蓝蛋白在基因结构、亚基结构、形态特征以及协同输氧的机制等多方面都不一样。软体动物血蓝蛋白是十聚体或二十聚体的中空柱状结构,每条亚基又由7或8个结合氧的功能单位(function unit,FU)依序连接而成。虽然已有软体动物血蓝蛋白单个FU的晶体结构,但至今仍无一高分辨的整体结构足以阐明各个FU、亚基的排布,以及FU间相互作用的方式、传递构象变化进行协同输氧的机制等。
本研究借助低温电镜三维重构(Cryo—Electron Microscopy3D Reconstruction)技术解析了软体动物腹足纲杂色鲍血蓝蛋白isoform1(Haliotis diversicolor Hemocyanin1,HdH1)的整体结构,尝试对上述问题进行探讨,并得到如下结果:
1.获得了分辨率约7.8A的HdH1三维结构;
2.测定了HdH1基因的大部分序列,并用同源建模方法构建了HdH18个FU的结构模型;结合低温电镜重构的电子密度图,构建了整体HdH1的pseudo—atomic model;
3.通过电子密度图,首次在血蓝蛋白中,发现了HdH1亚基二聚体中具有稳定结构功能的FU“互锁”(interlock)结构,并确认了各FU的依序排布方式;
4.发现了HdH1中两个十聚体结合形成二十聚体的位点,结合model分析,确认了由FU—A的His271、Gln272,以及另一个十聚体中FU—B的His304组成了HdH1形成二十聚体的结构基础;
5.发现了HdH1中FU相互作用的几个位点,揭示了HdH1相邻二聚体以及上下十聚体中,存在由其中的四个FU集合而成的一个产生变构和协同效应的基本单位;这些变构基本单位分别可通过两种作用方式依次传递信息,产生变构协同效应,同步进行氧的结合和释放。
软体动物血蓝蛋白具有输氧和免疫的功能,本论文利用低温电镜三维重构技术获得的这些结果,为研究血蓝蛋白的这些功能提供了重要的结构信息。