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目的:宫颈癌目前仍是最为棘手的妇科肿瘤之一，近年来死亡率逐年上升且呈现年轻化的趋势，而且多数病人在手术、放化疗后短期内复发，5年存活率徘徊在30％～65％。因此寻求新的疗法迫在眉睫。诱导细胞凋亡是很有前途的肿瘤治疗方法，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)具有强大的致细胞凋亡的能力，能够成为理想的肿瘤治疗因子，但caspase-3不能自身活化，因此本研究根据Srinivasula等的方法构建了一种新型的caspase-3前体——活性caspase-3(rev-caspase-3)，该分子能在不依赖上游起始caspase的刺激而自发折叠、自我激活，并具有很强的致细胞凋亡的能力。为了防止治疗基因对正常细胞的毒性作用，实现其在肿瘤组织中的靶向表达十分必要。应用肿瘤特异性启动子对治疗基因进行转录水平调控是很有效的方法。已有研究证实，人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)能够作为理想的肿瘤特异性启动子应用于癌症的基因治疗。但其转录活性低，只相当于人巨细胞病毒启动子(CMVp)活性的20％-30％，不能满足治疗基因高水平表达的需要。二步转录增强(TSTA)系统是由2套转录单位组成的具有转录增强作用的转录系统，最常用的转录激活因子-GAL4-VP16，是一种由酵母菌转录激活因子GAIA的DNA结合域和人单纯疱疹病毒Ⅰ型转录激活因子VP16组成的融合蛋白，具有强大的转录增强作用。因此引入GAL4-VP16，与hTERTp共同组成具有转录增强作用的激活系统，该系统能使治疗基因在肿瘤组织中表达水平显著提高。之前的研究已经证实，TSTA-hTERTp在宫颈癌细胞中的转录活性是hTERTp的90倍，而在正常细胞中的转录活性与hTERTp无显著差异。目前已成功制备了TSTA-hTERTp调控的活性caspase-3重组腺病毒AdHTVP2G5-rev-casp3，本研究中拟用该重组病毒进行体外实验，以检测其对人宫颈癌的治疗作用。
方法：采用基因重组法构建AdHTVP2G5-rev-casp3，AdHTVP2G5-EGFP，经DNA测序鉴定并证实其序列正确。分为以含TSTA-hTERTp调控下活性caspase-3的重组腺病毒AdHTVP2G5-rev-casp3(AdHTVP2G5-rev-casp3组)实验组；以含TSTA-hTERTp调控下的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组腺病毒AdHTVP2G5-EGFP(AdHTVP2G5-EGFP组)为阴性对照转染人宫颈癌细胞系Hela细胞及正常人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞。采用蛋白印迹法(western blot)、细胞计数法(CCK-8)、流式细胞术分别检测各组Hela和ECV304细胞中caspase-3的活性单位p17蛋白的表达强度、细胞存活率、细胞凋亡率和细胞周期的变化；采用电镜观察细胞的凋亡形态。
结果：
1、AdHTVP2G5-rev-casp3感染Hela细胞后有活性caspase-3表达，在AdHTVP2G5-rev-casp3(MOI=70)作用后36h～48h时p17蛋白表达水平较高，到72h时表达开始减弱。而感染ECV304细胞后无活性caspase-3表达。
2、当病毒的感染复数(MOI)为70时，Hela细胞存活率和凋亡率，AdHTVP2G5-rev-casp3组（分别为17.5％和19.02％）与AdHTVP2G5-EGFP（分别为102.3％和0.0％）比较，差异有统计学意义；而ECV304细胞的存活率和凋亡率，AdHTVP2G5-rev-casp3组（分别为100.7％和0.0％）与AdHTVP2G5-EGFP组（分别为101.3％和0％)比较，差异则无统计学意义。
3、在AdHTVP2G5-rev-casp3以MOI=70滴度感染Hela后72h观察，电镜下见大量凋亡改变的细胞，出现明显的凋亡形态。
结论：
1、重组分子rev-caspase-3具有强大的致细胞凋亡能力。
2、表达TSTA-hTERTp系统调控下rev-caspase-3的重组腺病毒AdHTVP2G5-rev-casp3同时具有高效的致细胞凋亡能力和肿瘤靶向性。