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非酒精性脂肪性肝脏疾病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是目前备受关注的一种疾病状态,由非酒精因素引起,以肝脏内脂肪堆积为特征,包含了一系列组织学改变,包括肝脏脂肪变性、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。肥胖、2型糖尿病、高脂血症等是NAFLD的重要危险因素,但NAFLD的发病机理仍不十分明确。同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是蛋氨酸在体内代谢产生的含硫氨基酸,临床上血浆同型半胱氨酸浓度升高(>15μM)称为高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia,HHcy)。HHcy是心血管疾病、糖尿病、免疫性以及神经退行性疾病的重要危险因素。近年来的研究表明,HHcy与NAFLD的发病也密切相关。NAFLD病人血浆Hcy的水平高于正常对照人群;高蛋氨酸饮食(High-methionine diet,HMD)喂养小鼠出现HHcy的同时伴有肝脏的脂质沉积。在不同HHcy模型中,已发现HHcy可致肝脏脂质代谢紊乱,但具体致病机制仍不明确。本课题旨在进一步阐明HHcy诱发肝脏脂肪变性的分子机制,以期为减轻HHcy引发的脂肪肝疾病提供新的治疗思路和潜在靶点。我们首先用2%(wt/wt)的HMD分别喂养6周龄C57BL/6雄性小鼠4周和8周建立HHcy模型,发现血浆Hcy的水平显著增加。肝脏油红O染色和肝脏脂质抽提结果表明,与正常饮食组相比,HMD喂养的小鼠肝脏出现明显的脂质沉积。为了明确HHcy引起肝脏脂肪变性的具体机制,我们检测了肝脏脂质代谢相关基因的表达,其中参与脂肪酸(Fatty acid,FA)摄取的关键基因清道夫受体CD36的mRNA和蛋白质水平在4周HMD喂养时显著增加并持续至8周。体外实验结果显示,给予原代肝细胞Hcy处理24小时可在诱导肝细胞脂质沉积的同时上调肝细胞CD36的表达。而CD36作为肝细胞对FA摄取的重要膜受体,参与了肝细胞对长链FA的摄取。进一步研究发现Hcy可增加小鼠原代肝细胞对长链FA的摄取,siRNA敲减原代肝细胞中CD36的表达则改善Hcy所致肝细胞脂质沉积及FA摄取增加,以上结果表明CD36是HHcy引发肝脏脂肪变性的早期反应因子。有关CD36表达调控的研究显示,CD36是多种转录因子调控的靶点。为了明确HHcy引起CD36表达上调的机制,我们筛选了参与CD36表达调控并且和肝脏脂质代谢密切相关的转录因子及其靶基因的表达。其中,芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AHR)靶基因(Cyp1a1,Cyp1a2,CD36)的表达在HMD喂养4周和8周均明显增加。此外,在原代肝细胞中用siRNA敲减AHR及其靶基因的表达或使用ahr拮抗剂ch223191抑制ahr的活性,均可明显抑制hcy诱导的cd36表达上调、肝细胞fa摄取增加和脂质聚积,表明ahr的激活参与了hcy诱导的肝细胞脂质沉积和cd36表达上调。过表达ahr可通过上调cd36的表达诱发肝脏的脂肪变性。本研究通过染色质免疫共沉淀实验证实hcy促进了ahr与cd36启动子区域的结合;荧光素酶报告基因检测显示hcy增加了ahr反应元件的活性,并且此过程是由内源性配体所介导。核受体ahr是由配体激活的转录因子。多种花生四烯酸(arachidonicacid,aa)的代谢产物已被证实是ahr的内源性配体。本实验室的前期研究表明hhcy参与调节了aa代谢通路关键酶的活性。采用aa靶向代谢组学的方法分析发现脂氧化酶通路的代谢产物lxa4的水平显著增加,而lxa4是已知的ahr内源性配体。对参与lxa4生物合成和代谢失活基因表达分析发现,hmd显著下调了lxa4代谢失活酶15-前列腺素氧化13-还原酶1的表达,提示lxa4含量的增加可能由于lxa4的代谢失活被抑制。为了明确lxa4是否在hcy诱导的肝细胞脂质沉积中发挥了重要作用,我们过表达15-前列腺素氧化13-还原酶1,发现其明显抑制了hcy诱导的cd36表达上调、fa摄取增加和脂质沉积;瞬时转染实验表明lxa4可与ahr的配体结合域结合,促进ahr转位入核,增加了ahr反应元件的活性。给予原代肝细胞lxa4处理上调了ahr靶基因cyp1a1,cyp1a2和cd36的表达,增加了肝细胞fa摄取和脂质沉积,而siahr则逆转了lxa4的上述作用。因此,lxa4以配体依赖方式激活ahr-cd36信号路径,参与hcy致肝脏脂质代谢紊乱的过程。为了进一步明确ahr在hhcy诱导肝脏脂肪变性中的关键作用,我们在hmd喂养c57bl/6小鼠的同时给予ahr拮抗剂ch223191(10mg/kg/day饮水)分别喂养4周和8周,ch223191明显减轻了hmd喂养引起的肝脏脂质沉积,同时抑制了肝脏中ahr靶基因cyp1a1,cyp1a2和cd36的mrna表达。这些结果表明抑制ahr的活性可通过降低cd36的表达保护hmd诱导的肝脏脂肪变性。为了将动物实验与临床研究相结合,我们对hhcy与nafld发病的相关性研究进行了连续性变量的meta分析,发现nafld病人血浆hcy水平高于正常对照人群,说明hhcy是nafld发病的重要危险因素。结论:我们的研究表明,hmd可诱导肝脏脂肪变性的发生。hhcy增加了aa的代谢产物lxa4的含量,lxa4作为ahr的内源性配体激活了ahr-cd36信号路径,促进了肝细胞FA摄取和脂质沉积。AHR拮抗剂CH223191可以有效地减轻HHcy诱导的肝脏脂肪变性,为临床治疗提供了潜在的靶点。