论文部分内容阅读
目的炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种常见的疾病,与肠道固有免疫和适应性免疫紊乱有关,主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)两种类型,目前已成为21世纪全球性疾病。从花椰菜中提取的萝卜硫素(sulforaphane,SFN)已被证明可以预防炎症,但其确切的分子机制目前尚不清楚。本研究旨在探讨SFN对葡聚糖硫酸钠盐(dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导小鼠体内结肠炎的炎症抑制作用,以及对脂多糖体外刺激RAW 264.7细胞的抗炎作用,并阐明其潜在机制。第一部分SFN对DSS诱导小鼠结肠炎症损伤的保护作用方法1.以DSS诱导的小鼠急性结肠炎为实验模型,于造模0天开始,每天记录小鼠体重变化,大便次数、性状及便血情况,造模10天处死小鼠后,记录小鼠结肠宏观改变,病理组织切片后行结肠炎症相关组织学改变评分。2.采用RT-PCR检测小鼠结肠组织中M1/M2型巨噬细胞极化标志物iNOS/Arg-1,以及小鼠结肠组织中miR-155,QKI,AHR mRNA表达水平。3.Western blot检测Nrf2,QKI,STAT1,IκB-α,NF-κB p65,NLRP3蛋白在小鼠结肠组织中的表达变化。结果1.给予C57BL/6小鼠2%DSS持续口服7天后,小鼠出现明显的体重下降、腹泻及便血表现。其病理主要表现为小鼠结肠缩短,上皮细胞损伤,糜烂或溃疡形成,严重中性粒细胞浸润;给予SFN治疗后可明显改善DSS诱导急性结肠炎小鼠体重减轻的情况,疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分明显减低。2.RT-PCR检测发现,SFN明显抑制DSS诱导小鼠急性结肠炎组织中M1型巨噬细胞的极化,其标志物iNOS显著降低;SFN明显促进组织中M2型巨噬细胞的极化,其标志物Arg-1显著增高,产生抗炎作用。3.病理组织切片实验H.E显示给予SFN治疗后,小鼠结肠组织炎症损伤明范围明显减少,明显改善小鼠结肠组织隐窝结构的破坏、杯状细胞的缺失及中性粒细胞严重浸润的现象。4.RT-PCR检测结果显示DSS诱导小鼠结肠炎组织中miR-155增高,QKI、AHR降低,给予SFN治疗后,对miR-155的表达有明显的抑制作用,而对QKI、AHR的表达有明显的促进作用,产生抗炎。5.Western blot实验检测方法发现,急性结肠炎组织中Nrf2、QKI、IκB-α降低,而NF-κB p65、NLRP3增高,给予SFN治疗后,明显抑制了急性结肠炎组织中Nrf2、QKI、IκB-α蛋白表达的降低及NF-κB p65、NLRP3蛋白表达的增高,减轻炎症作用。第二部分SFN通过抑制M1型巨噬细胞极化抵抗炎症损伤方法1.为了验证动物实验中SFN抑制DSS诱导急性小鼠结肠炎炎症的作用机制及相关靶点途径,体外实验中,我们选用目前最常用的细胞株RAW 264.7作为细胞系。2.采用CCK8实验检测不同浓度的SFN对RAW 264.7细胞毒性作用,选取SFN刺激巨噬细胞的最佳浓度。3.脂多糖(LPS)联合干扰素γ(interferon gamma,IFN-γ)或IL-4刺激巨噬细胞的条件下,分别同时给予SFN处理。4.采用RT-PCR检测不同刺激后巨噬细胞中iNOS,Arg-1,miR-155,QKI,AHR mRNA表达变化。5.采用Western blot检测不同刺激后巨噬细胞中Nrf2,QKI,STAT1,NF-κB p65,NLRP3蛋白表达水平。结果1.采用CCK8实验检测不同浓度SFN作用于RAW 264.7细胞24h后其毒性变化,发现当SFN的最大浓度为10μM时,对RAW 264.7细胞不产生增殖抑制作用。2.RT-PCR技术检测发现,SFN可以明显抑制M1型巨噬细胞极化诱导因子LPS+IFN-γ刺激RAW 264.7细胞后iNOS mRNA的表达,促进M2型巨噬细胞极化诱导因子IL-4刺激RAW 264.7细胞后Arg-1 mRNA表达。3.RT-PCR检测发现SFN可以明显抑制LPS+IFN-γ刺激RAW 264.7细胞后miR-155表达的上调。4.RT-PCR结果显示,LPS+IFN-γ刺激RAW 264.7细胞后QKI、AHR明显降低,IL-4刺激RAW 264.7细胞后QKI、AHR明显增高;分别同时给予SFN处理可以显著上调QKI、AHR mRNA的表达。5.采用Western blot实验方法检测LPS+IFN-γ刺激RAW 264.7细胞后,Nrf2、QKI蛋白下调,同时给予SFN后可以明显增加其表达。6.Western blot结果显示,SFN可以促进LPS+IFN-γ刺激后RAW 264.7细胞中STAT1的活化。7.采用Western blot发现给予SFN可以抑制LPS+IFN-γ刺激RAW 264.7细胞后NF-κB p65的活化及NLRP3蛋白的表达。结论1.SFN可以明显改善结肠炎小鼠体重下降、DAI评分、宏观评分、结肠炎症相关组织评分的情况,同时对于结肠炎小鼠结肠缩短、结肠组织变薄、糜烂或溃疡形成及上皮细胞损伤均有显著的缓解作用。组织学可见结肠黏膜炎症损害区域减少,黏膜水肿、溃疡形成、隐窝结构破坏、隐窝脓肿、杯状细胞耗竭、中性粒细胞浸润等程度均明显减轻。2.SFN在显著降低结肠炎小鼠结肠组织M1型巨噬细胞标志物iNOS的同时显著提高M2型巨噬细胞标志物Arg-1的表达水平,可能是依赖抑制结肠炎组织巨噬细胞中miR-155表达而促进QKI/AHR信号转导与STAT1形成复合物参与抑制NF-κB p65磷酸化和NLRP3的表达,从而抑制巨噬细胞M1型极化,发挥抗炎作用。