临床用药引起的药物毒副作用一直是困扰广大患者和医疗工作者的重要问题,这其中不乏一些严重的不良反应。例如,长期或大量使用非甾体抗炎药（NSAIDs）会造成胃肠道的损伤,导致胃肠道溃疡、糜烂、出血、穿孔等;长期或大量使用对乙酰氨基酚（APAP）会引起肝肾损伤,导致肝肾功能异常。广泛研究表明,组织损伤部位局部微环境存在异常升高的活性氧（ROS）,导致氧化应急水平的增高,氧化与抗氧化能力的失调,产生过氧化反应,从而进一步加重组织损伤。因此,降低组织损伤部位的氧化应激水平,清除自由基成为治疗药物引起的副作用的新方式。然而,口服小分子药物的传统制剂往往导致药物的非特异性组织分布,且小分子药物的体内半衰期较短,需频繁给药,故多数情况下防治效果并不理想,且可能引起新的不良反应。近期研究表明,纳米药物由于其特殊的纳米尺寸效应,可以在组织损伤部位特异性分布,有效增加药物引起的组织损伤的防治作用,并显著降低副作用。但目前该领域研究的大多数纳米系统在体内降解和代谢清除方面存在一定问题,影响了其长期使用的安全性。为解决上述问题,本课题拟通过构建具有过氧化氢（H₂O₂）清除能力的载体材料,装载具有自由基清除功能的4-羟基TEMPO（Tpl）,自组装形成纳米粒。该纳米粒具有ROS响应性,可靶向到氧化应激水平升高的组织损伤部位,并在ROS的作用下,水解释放出Tpl,达到对药物引起的组织损伤的靶向治疗作用。方法1.H₂O₂清除性载体材料的合成与表征将9.44 mmol的N,N-羰基二咪唑（CDI）与4.72 mmol的4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯（PBAP）溶于无水二氯甲烷（DCM）中,25℃搅拌1 h,用去离子水和饱和Na Cl溶液各洗3次,再用Na₂SO₄干燥30 min。过滤、干燥滤液,得到CDI活化的PBAP（CDI-PBAP）。将1.52 g的CDI-PBAP溶解于二甲基亚砜（DMSO）中,再加入250 mg的β-环糊精（β-CD）和0.8 g的4-二甲氨基吡啶（DMAP）,25℃磁力搅拌过夜,加入去离子水沉淀,离心,去离子水清洗沉淀3次,-80℃冻干沉淀,即得到具有H₂O₂清除性的β-CD材料（Ox-bCD）。用傅里叶变换红外光谱仪（Fourier Transform Infrared Spectrometer,FTIR Spectrometer）和核磁共振波谱仪对Ox-bCD进行结构表征。2.空白纳米粒的制备卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG2000）溶于无水乙醇并分散在水中,65℃搅拌1 h。将溶于无水甲醇中的Ox-bCD滴加到上述溶液中,室温搅拌2 h,10000 rpm离心10 min,得到空白纳米粒（NPs）。测定其粒径大小及表面电位,利用透射电镜（TEM）对纳米粒的形貌进行表征。3.空白纳米粒水解性能的评价将5 mg的NPs分别加入到磷酸缓冲盐溶液（PBS）和不同浓度的H₂O₂溶液中,通过紫外可见分光光度计测其透光率。4.ROS清除性载药纳米粒的制备卵磷脂和DSPE-PEG2000溶于无水乙醇中,65℃搅拌1 h。将溶于无水甲醇中的Ox-bCD和Tpl滴加到上述溶液中,室温搅拌2 h,10000 rpm离心10 min,得到载药纳米粒（Tpl-NPs）。测定其粒径大小及表面电位,利用TEM对纳米粒的形貌进行表征,高效液相（HPLC）测其载药量。5.ROS清除性纳米粒的体外释放评价配制pH 1.2的PBS溶液及p H 7.4的PBS溶液分别模拟胃肠道的酸碱环境,将载药纳米粒Tpl-NPs置于此模拟环境中,于特定时间取释放液。通过HPLC测Tpl的释放量。6.体外ROS清除性能测定配制30 m M的H₂O₂溶液,并用此溶液配制0.064、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/m L的Tpl-NPs（或Ox-bCD）溶液,37℃孵育48 h后测定溶液中剩余的H₂O₂的量,并绘制清除H₂O₂曲线。同时,配制0.064、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/m L的Tpl-NPs（或Ox-bCD）溶液,按照抗超氧阴离子自由基试剂盒说明书进行检测,并绘制抗超氧阴离子活力单位曲线。7.口服ROS清除性纳米粒在NSAIDs引起的胃肠损伤小鼠体内的分布研究卵磷脂和DSPE-PEG2000溶于无水乙醇中,65℃搅拌1 h。将溶于无水甲醇中的Ox-bCD和花青素染料7.5（Cy7.5）滴加到上述溶液中,室温搅拌2 h后,10000 rpm离心10 min,得到装载Cy7.5的纳米粒（Cy7.5-NPs）,测定其粒径大小及表面电位,利用透射电镜（TEM）对纳米粒的形貌进行表征。口服Cy7.5-NPs后,于不同时间点处死小鼠并解剖小鼠取胃、空肠、回肠、结直肠,用活体成像系统观察并统计荧光强度。8.口服ROS清除性纳米粒治疗NSAIDs引起的胃肠损伤的药效学评价雄性Balb/c小鼠禁食12 h后,通过口服吲哚美辛（IND）建立NSAIDs介导的胃肠损伤模型,在口服吲哚美辛前1 h口服生理盐水、Tpl、NPs、Tpl-NPs、铝碳酸镁。12 h后取胃、空肠、回肠做苏木精-伊红（H&E）染色切片,胃、空肠、回肠的组织匀浆液测定过氧化氢酶（CAT）、过氧化氢（H₂O₂）、丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）、IL-1β、IL-10、TNF-α的含量。9.口服ROS清除性纳米粒对NSAIDs引起的胃肠损伤的生存率评价雄性Balb/c小鼠口服生理盐水、Tpl、NPs、Tpl-NPs、铝碳酸镁,1 h后口服吲哚美辛。以此方式连续给药10天,每天观察其生存状态,统计其死亡个数。10.静脉注射ROS清除性纳米粒对APAP引起的肝损伤的初步药效学评价雄性C57小鼠禁食15-18 h,通过腹腔注射对乙酰氨基酚（APAP）建立急性肝损伤模型,并给与正常饲养,6 h后尾静脉注射生理盐水、Tpl-NPs,12 h后取肝脏做H&E染色切片,肝脏的组织匀浆液测定H₂O₂、MDA、MPO、IL-1β、IL-10和TNF-α的含量。11.ROS清除性纳米粒在细胞水平的初步安全性评价将巨噬细胞（RAW264.7）种植于孔板,与含血清培养基配制的纳米粒溶液共孵育12或24 h后,MTT法测定细胞存活率。12.ROS清除性纳米粒的体外溶血实验提取雄性大鼠的红细胞,与不同浓度Tpl-NPs涡旋混合后,室温放置2 h,离心取上清,加到96孔板进行血红蛋白的含量测定。13.口服ROS清除性纳米粒的初步安全性评价通过一次性口服2.5 g/kg、5.0 g/kg的Tpl-NPs,每两天记录一次体重,两周后取全血测血常规,取血清测肾功能、肝功能,取各脏器及胃、十二指肠、空肠、回肠做H&E染色切片,并统计脏器指数。结果1.通过设计得到了具有H₂O₂清除性能的载体材料,核磁共振结果显示β-CD上含有5个PBAP单元。2.基于纳米沉淀法,成功的得到了空白纳米粒和载药纳米粒,粒径分别为136.9和146.1 nm,表面电位分别为为-30.9和-24.7 mV,其中Tpl-NPs中Tpl的载药量约为15%。3.ROS清除性纳米粒在PBS溶液中几乎不水解,在不同浓度的H₂O₂溶液下水解率不同,且随着H₂O₂浓度增大,水解率增大。在模拟胃肠道pH条件下,ROS清除性纳米粒在pH 1.2的酸性介质中药物释放缓慢,而在p H 7.4和H₂O₂共同存在的条件下释放较为迅速。4.ROS清除性能实验表明,Tpl-NPs（Ox-bCD）清除H₂O₂呈线性关系,抗超氧阴离子活力单位呈曲线,在一定范围内呈线性。5.活体成像结果显示,口服Cy7.5-NPs后,Cy7.5在胃肠损伤模型组中比正常小鼠组中聚集的时间更长,荧光强度也更强。6.基于胃肠损伤模型的药效学实验结果显示,口服Tpl-NPs后,胃、空肠、回肠部位的氧化应激水平降低,生存率提高,通过H&E染色组织切片结果看到组织损伤减小。7.在肝损伤模型中,静脉注射Tpl-NPs对APAP引起的肝脏损伤起到了治疗与保护作用。8.初步安全性结果显示,Tpl-NPs对RAW264.7巨噬细胞无明显毒性;同时对红细胞无溶血现象。口服高剂量ROS清除性纳米粒未见血常规、肾功能和肝功能的改变;H&E染色组织切片未见脏器及胃、十二指肠、空肠、回肠部位病理性变化。结论1.通过将PBAP共价键合于β-CD上,得到了具有ROS响应性和H₂O₂清除能力的β-环糊精载体材料,即Ox-bCD。2.用改良的纳米沉淀/自组装法成功制备了空白纳米粒和负载自由基清除剂Tpl的纳米粒,其形态良好,粒径分布均一,其具有ROS响应性;且体外实验证明Tpl-NPs能有效清除H₂O₂和超氧阴离子。3.口服或静脉给药后,Tpl-NPs能够靶向于氧化应激水平增高的组织损伤部位,靶向至损伤部位后,缓慢释放Tpl,延长其在损伤部位的保留时间。通过消耗局部组织中的H₂O₂,并利用释放的Tpl清除自由基,起到对胃肠损伤及肝脏损伤的保护与治疗且副作用较低。4.ROS清除性纳米粒对细胞的毒性较小,一次大剂量口服后对血常规、肝功能和肾功能无影响,对胃肠组织无刺激。静脉注射对红细胞无溶血现象。综上所述,本课题通过构建H₂O₂清除性的载体材料,以其负载自由基清除剂Tpl,合成了ROS清除性Tpl-NPs纳米粒,该纳米粒可靶向到组织损伤部位,延长自由基清除剂的体内保留时间,有望成为一种新的抗NSAIDs和APAP副作用的纳米药物。