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目的:三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC),是所有乳腺癌类型中恶性程度最高的一种。为了探究更多有效的治疗药物,前期实验中,我们在天然化合物库中进行了 TNBC抑制剂的筛选,并鉴定出了芹菜素是一种潜在的抑制剂。本实验旨在探讨芹菜素对TNBC细胞的抑制作用及其分子作用机制。方法:(1)芹菜素对TNBC细胞增殖影响的检测:本实验中使用的TNBC细胞为MDA-MB-231 和 MDA-MB-436,我们用 0、2、4、8、16、32、64μM 浓度的芹菜素对这两种TNBC细胞系进行干预(24、48、72 h),采用SRB比色法检测芹菜素对两种TNBC细胞系细胞活力的影响。用平板克隆形成实验检测芹菜素对两种TNBC细胞系增殖能力的影响,此实验中用0、5、10、20、40 μM浓度的芹菜素对两种TNBC细胞系进行干预72 h,再用正常培养基培养十天,染色后进行图像拍摄和克隆计数。(2)芹菜素对TNBC细胞迁移能力影响的检测:用划痕实验检测芹菜素对两种TNBC细胞系迁移能力的影响。对TNBC细胞进行划痕后,选用0、5、10、20μM的芹菜素在无血清条件下对TNBC细胞进行干预。对六孔板每个孔的相同位置进行拍照并分析(0、12、24 h)。另外用Transwell实验进行进一步验证,两种TNBC细胞系用芹菜素预处理24 h以后,加入Transwell小室中,24 h以后进行固定染色,于倒置显微镜下拍照计数,并对细胞数目进行统计。(3)芹菜素对TNBC细胞乳腺癌干细胞(BCSCs)性能影响的检测:我们用0、10、20μM的芹菜素对MDA-MB-231 和MDA-MB-436进行干预72 h,用anti-CD24-PE和anti-CD44-FITC抗体进行染色,于流式细胞仪检测CD44+/CD24干细胞亚群百分比的变化情况。另外我们还进行了肿瘤干细胞成球实验检测芹菜素对TNBC细胞微球体形成能力的影响。我们用0、10、20 μM的芹菜素对两种TNBC细胞系进行干预72 h。而后将细胞在超低附着板中培养10天,于显微镜下拍摄图像并计算微球体的数目。(4)芹菜素对TNBC细胞分子作用机制的检测:用0、5、10、20μM的芹菜素对 MDA-MB-231 和 MDA-MB-436 干预 72 h,用 RT-qPCR 检测 Hippo 通路下游基因CTGF、CYR61 mRNA表达水平。用Western Blot检测芹菜素对Hippo信号通路相关蛋白水平的影(YAP、TAZ、CTGF、CYR61)。最后用CO-IP检测芹菜素对YAP/TAZ-TEADS蛋白间相互作用的影响。(5)芹菜素体内抗肿瘤形成能力的检测:将18只裸鼠随机分成6组(A组、B组、C组、D组、E组、F组),A组、B组、C组分别注射1x106、1x105、1x104的0.1%DMSO预处理过的MDA-MB-231细胞(对照组),D组、E组、F组分别注射1×106、1×105、1×104芹菜素预处理过的MDA-MB-231细胞(给药组)。每组3只裸鼠,其中一只双侧皮下注射,另外两只单侧注射。每两天观察一次裸鼠的生长状况,每周记录一次肿瘤形成率、肿瘤体积和肿瘤重量。实验结束时记录剥离出的肿瘤的体重和体积,并拍摄图像。结果:(1)芹菜素抑制了 TNBC细胞的增殖:SRB比色法实验结果显示芹菜素对正常乳腺组织细胞毒性较小,且能够抑制TNBC细胞的增殖,其抑制作用与药物干预剂量和时间呈依赖性。芹菜素干预72 h后,在TNBC细胞系MDA-MB-436和MDA-MB-231中,IC50值分别约为30和33μM。平板克隆形成实验结果显示芹菜素显著降低了两种TNBC细胞系的平板克隆形成率。(2)芹菜素抑制了 TNBC细胞的迁移:划痕实验结果表明芹菜素10和20 μM浓度能够显著减少MDA-MB-231和MDA-MB-436的迁移距离。Transwell迁移实验中,对Transwell小室迁移细胞数目进行统计分析可知,芹菜素能够使MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞迁移数量显著减少,其抑制作用与芹菜素的干预剂量呈依赖性。(3)芹菜素抑制了 TNBC细胞BCSCs性能:流式细胞分析结果表明在MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞中芹菜素降低了 CD44+/CD24-肿瘤干细胞亚群的百分比。肿瘤干细胞成球实验中,芹菜素显著减少了两种细胞系形成乳腺球的数量,表明芹菜素能够降低TNBC细胞的自我更新能力。(4)芹菜素通过Hippo通路抑制了 TNBC细胞相关基因和蛋白水平的表达:RT-qPCR及Western Blot结果显示,芹菜素未使Hippo信号通路中YAP和TAZ的蛋白表达水平发生明显变化,但是芹菜素以剂量依赖性的方式显著降低了下游靶基因CTGF和CYR61的mRNA和蛋白表达水平。同时芹菜素破坏了 YAP/TAZ-TEADS蛋白与蛋白间的相互作用。(5)芹菜素抑制了 TNBC细胞的致瘤潜能:当裸鼠皮下注射的MDA-MB-231细胞数目分别为1X 106、1 X 105、1X 104时,对照组裸鼠移植瘤形成率为100%、100%和75%,给药组裸鼠肿瘤形成效率分别下降到50%、25%和0。与对照组相比,给药组裸鼠肿瘤生长明显迟缓,且实验结束后剥离出的肿瘤体积和重量明显下降。结论:芹菜素能抑制TNBC细胞的增殖、迁移及BCSCs性能,抑制Hippo通路下游效应因子YAP/TAZ的活性,逆转TNBC的恶性表型,有可能开发成为TNBC高YAP/TAZ活性患者的治疗药物。