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水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的成员,可引起水稻黑条矮缩病、玉米粗缩病等。RBSDV基因组有10条双链RNA(S1-S10),共编码13种蛋白,其中S1编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),S10编码外壳蛋白(CP);S5,S7,S9是双顺反子,各编码两个蛋白。RBSDV基因组5’端有帽子结构,而3’端无poly(A)尾。利用RT-PCR方法克隆了水稻黑条矮缩病毒江苏玉米分离物的全基因组序列。RBSDV江苏玉米分离物(RBSDV-JS)基因组中最长的为4 501bp,最短的为1 801 bp。软件预测表明S5,S7,S9也含有两个开放阅读框(ORF),其余基因组片段均含有一个ORF,RBSDV-JS基因组的10条片段的大小与蛋白编码情况与GenBank中的已报道RBSDV信息基本一致。基因组序列一致性分析显示,RBSDV-JS各基因组片段与GenBank中大部分RBSDV分离物对应片段的序列一致率均在94%以上。系统进化树显示,各基因组片段呈现单独进化的特征,存在RNA重排现象。综合基因组序列一致性和系统进化树分析,表明江苏玉米分离物与湖北玉米分离物和河北小麦分离物的整体亲缘关系较近,而与安徽水稻分离物(AH-MX8)的整体亲缘关系最远。RNA重组分析显示,RBSDV基因组不同片段的进化中RNA重组的作用不同:S1、S2和S4中未发现RNA重组;S3、S5、S6、S8和S10中存在低频率重组;S7和S9中存在较高频率重组,其中S7中尤为显著。RBSDV的10条双链RNA末端存在保守的序列,5’末端为5-AAGTTTTT,3’末端为CAGCTA(G)T(C/A)T(C)GTC-3;另外在保守序列内还存在7-11个反向碱基互补。为研究这些元件对翻译的调控作用,将RBSDV基因组的S3和S10的5’非编码区(5’UTR)和3’非编码区(3’UTR)分别插入到萤火虫荧光素酶(Fluc)的上下游,通过测定Fluc读数分析不同片段对翻译的调控。以此载体为基础,同时构建一系列突变体,深入分析RBSDV的5’UTR和3’UTR对翻译的调控作用。研究表明:(1)S3,S10的5’UTR对Fluc的翻译起正调控作用;其中将S3的5’UTR的1-4位,9-10位,11-12位或9-12位碱基突变,均明显降低Fluc读数;而S10的5’UTR的1-4位,9-12位或15-18位突变,也明显降低Fluc读数,表明S3和S10的5’UTR的细微突变均明显影响其对翻译的正调控作用;反式竞争实验初步表明5’UTR可能通过结合核糖体亚基或翻译起始因子起作用,属于一类结构简单的核糖体内部起始位点(IRES);(2)在5’UTR存在的情况下,3’UTR可抑制5’UTR的正调控作用;突变实验表明这种抑制来自于5’和3’末端反向碱基互补。为构建RBSDVRdRp介导的体外复制体系,构建MBP融合型原核表达载体。分别表达完整的RdRp、RdRp N端和C端多肽。经IPTG诱导,RdRp N端和C端多肽可获得表达,而完整的RdRp无法表达。下一步将利用亲和层析法纯化有活性的RdRp N端和C端多肽,进而建立RBSDV RdRp介导的体外复制体系。