棉蚜Aphis gossypii(Glover)属同翅目蚜科,是世界性分布的多食性害虫,抗药性发展迅速,抗性谱广,抗性治理难度大。吡虫啉是第一个商品化的新烟碱类杀虫剂,是目前防治棉蚜等刺吸式口器害虫的首选药剂。随着吡虫啉的大量频繁使用,包括棉蚜在内的多种害虫对其产生了抗药性。研究表明,昆虫对吡虫啉的代谢抗性主要与CYP基因编码的P450酶代谢活性升高有关。但大部分研究结果尚缺乏直接的证据证明这些基因编码的酶能够代谢吡虫啉,且不同昆虫中起关键作用的CYP基因也有差异。我们前期研究发现,棉蚜对吡虫啉的抗性主要与P450酶的活性升高有关,但目前尚未涉及到P450基因介导的棉蚜对吡虫啉的代谢分子机制研究。本文检测了山东省主要棉区棉蚜对吡虫啉的抗性,并以田间抗性种群(XJ和BZ)、室内筛选的抗性种群(RS,抗性72.6倍)和敏感种群(SS)为试材,通过增效试验、酶活测定、吡虫啉体内代谢、应用实时荧光定量PCR、RACE等技术,通过比较棉蚜抗敏品系体内CYP基因的mRNA表达水平,筛选并克隆出与抗性相关的CYP基因。并将克隆的CYP基因进行异源表达,采用生化及LC-MS/MS技术,分析该基因异源表达产物活性及其对吡虫啉的离体代谢作用。研究结果证实P450基因CYP6CY3-Ag过量表达能够导致棉蚜对吡虫啉产生抗性。具体研究结果如下:采用毛细管微量点滴法测定了山东主要棉区12个田间棉蚜种群对吡虫啉的抗性水平,结果表明,供试的12个田间棉蚜种群均对吡虫啉产生了不同水平的抗性,与敏感种群相比,抗性倍数在3.73—12.90之间。其中,夏津(XJ)和滨州(BZ)两个种群的抗性水平最高,抗性倍数分别为10.36和12.90;禹城(YC)和高唐(GT)两个种群的抗性水平最低,抗性倍数分别为3.73和4.24;其余8个田间种群对吡虫啉的抗性倍数在5.27—9.13之间。比较了酶抑制剂PBO(胡椒基丁醚)在敏感种群(SS)和3个抗性棉蚜种群(XJ、BZ、RS)中对吡虫啉的增效作用,结果表明,PBO对BZ种群的增效作用最显著,为5.43倍;其次是RS种群和XJ种群,分别为3.88倍和2.65倍;对SS种群的增效作用最不明显,为1.19倍。通过对底物PNOD(对硝基苯甲醚)的O-脱甲基作用测定,比较4个棉蚜种群的细胞色素P450酶的活性,结果表明,RS种群细胞色素P450酶活性最高,是敏感棉蚜种群的4.89倍;其次是BZ种群,是SS种群的3.98倍;XJ种群细胞色素P450酶活性与敏感种群差异不明显,仅为1.53倍。采用lc-ms/ms技术比较了rs抗性种群和ss敏感种群对吡虫啉的体内代谢能力。结果发现,随着处理时间的增加,两种群体内吡虫啉的含量均出现先上升后下降的趋势,其中,敏感种群棉蚜体内吡虫啉含量在处理后10h达到最大,为0.28±0.03ng/mg棉蚜;抗性种群棉蚜体内吡虫啉含量在处理后1h达到最大,为0.17±0.02ng/mg棉蚜;处理后24h,敏感种群棉蚜体内吡虫啉的含量是抗性种群棉蚜的1.91倍。而两种群体内4/5-羟基吡虫啉的含量呈现一直增加趋势,且抗性种群体内的4/5-羟基吡虫啉含量始终大于敏感种群。处理后24h,抗性和敏感种群棉蚜体内4/5-羟基吡虫啉的含量分别为2910±80和990±110峰面积/mg棉蚜,抗性种群是敏感种群的2.94倍。结果表明,两个棉蚜种群均能在体内代谢吡虫啉,代谢产物主要为4/5-羟基吡虫啉,且抗性种群棉蚜对吡虫啉的代谢能力要明显高于敏感种群棉蚜。分别根据cyp4和cyp6家族基因的氨基酸保守区设计兼并引物,采用rt-pcr技术,分别获得了大约440bp和390bp的目的基因片段,克隆测序后,最终获得了15条p450基因序列,在genbank中通过blastx或blastp比对并排除同一基因家族中的相同基因或者相同基因的等位基因,最终获得了4个cyp4家族基因和3个cyp6家族基因。采用实时荧光定量pcr技术比较了这7个p450基因在rs抗性种群和ss敏感种群中mrna的表达水平,结果表明,cyp4-like2-ag、cyp4-like4-ag、cyp6-like1-ag和cyp6-like3-ag4个基因在rs种群中的mrna表达量要明显高于ss种群,其在rs种群中的表达量分别为ss种群的16.77、6.29、4.82和12.86倍。进一步比较了这4个基因在田间两个抗性种群bz和xj体内的mrna表达水平,结果表明,cyp4-like2-ag和cyp6-like3-ag两个基因在bz和xj种群中的mrna表达量较高,其中,cyp4-like2-ag基因分别为ss种群的的6.05和4.74倍;cyp6-like3-ag基因分别为ss种群的4.97和3.07倍。但cyp4-like4-ag和cyp6-like1-ag两个基因在bz和xj两个种群体内的mrna表达量与ss种群差异不大。采用race技术,成功克隆到棉蚜的p450基因cyp6-like3-ag,其中rs和ss种群全长均为1386bp,含有全部的cds序列,编码区为1266bp,共编码456个有效氨基酸残基,5’和3’非编码区为13bp和107bp,起始密码子为atg,终止密码子为taa,预测分子量为53.112kda。根据国际p450命名委员会的命名规则命名为cyp6cy3。利用pfastbac载体,进行双酶切,构建cyp6cy3的重组质粒,运用bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统,体外成功表达了棉蚜的cyp6cy3基因。测定了表达产物对模式底物(pnod)的氧化代谢作用,结果表明,以pnod(对硝基苯甲醚)为底物测得蛋白活性为8.60 mOD/min/mgprotein。采用LC-MS/MS测定了表达产物对吡虫啉的离体代谢作用,结果表明,表达产物在NADPH再生系统中能成功代谢吡虫啉为4/5-羟基吡虫啉。