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近年来,耐药结核分枝杆菌的数量不断增多,尤其耐多药结核病(MDR-TB)和超级耐药结核病(XDR-TB)的出现使一线结核病药物无法达到治疗效果,全球结核病的有效控制面临着耐药结核菌的重大挑战。噬菌体及其裂解酶在其它菌属耐药性治疗上的成功报道提示,可以裂解结核分枝杆菌的分枝杆菌噬菌体D29具有治疗结核病的潜在价值。已有研究表明给药方式是噬菌体治疗的重要影响因素,本研究通过建立噬菌体D29气溶胶动物口鼻暴露模型,探讨气溶胶给药途径的药物输送效率以及噬菌体D29进入靶器官后的代谢规律,同时对噬菌体D29在各种给药途径下的免疫原性、安全性进行研究。噬菌体裂解酶经纯化后用于治疗细菌感染是近年来噬菌体治疗的一个重要途径。目前未见分枝杆菌噬菌体裂解酶治疗的有关报道,已鉴定出裂解酶的噬菌体也仅有一株,本研究试图鉴定出噬菌体D29的裂解酶基因,为其将来在耐药结核病治疗中的应用奠定研究基础。研究内容:1.建立噬菌体D29气溶胶豚鼠口鼻暴露模型;2.以滴鼻法为参照,评价气溶胶途径输送目标药物至豚鼠肺部的效率;3.研究噬菌体D29在豚鼠靶器官的代谢规律;4.研究不同暴露途径下噬菌体D29的免疫原性及安全性;5.对噬菌体D29裂解功能基因进行鉴定;6.构建噬菌体D29裂解酶基因的大肠杆菌表达载体。方法:1.噬菌体D29气溶胶豚鼠口鼻暴露模型的建立:将豚鼠按性别与体重均匀装入动物口鼻暴露装置的上下两层暴露筒中,使用DV40气溶胶发生器发生6×109PFU/ml噬菌体D29气溶胶。TSI3321气溶胶粒径分析仪监测暴露装置内所有气溶胶粒子分布情况,AGI-10液体冲击式采样器对暴露装置内的气溶胶粒子进行采集,Andersen二级采样器置于暴露装置外、气溶胶测试柜内,对柜内气溶胶进行采样,以监测暴露装置是否发生泄漏。气溶胶发生时间1h。双层培养计数法、实时荧光定量PCR法检测AGI-10采样器所采样本中的噬菌体D29数量,计算暴露装置内噬菌体D29气溶胶粒子浓度。2.气溶胶途径及滴鼻途径暴露豚鼠后分别于1h、8h、24h处死,解剖取其全肺及气管,制备肺组织匀浆液和气管浸润液,采用双层培养计数法、实时荧光定量PCR法检测其中的噬菌体D29含量。比较气溶胶途径和滴鼻途径豚鼠噬菌体D29的摄入量,评价气溶胶途径的药物输送效率。对不同时间点噬菌体D29在肺部的活菌数和总菌数进行统计分析,总结噬菌体D29在豚鼠肺部的代谢规律。3.噬菌体D29通过气溶胶(109PFU/ml发生液)、滴鼻(108PFU/50μl,108PFU/200μl)和皮下注射(108PFU/200μl)途径暴露豚鼠,同时设立气溶胶、滴鼻途径的7H9培养基、生理盐水对照。首周暴露两次,以后每周暴露一次,每周第七天采血,五周后处死豚鼠并进行解剖。观察和检定以下指标:动物一般情况;脏器肉眼病变程度;脏器病理组织学检查;噬斑减少中和实验测定血清中噬菌体D29的中和抗体效价;ELISA法检测血清IL-2、IL-4、IFN-γ含量。4.在对噬菌体D29开放阅读框序列分析基础上,用PCR法从噬菌体D29基因组DNA中扩增出与裂解酶同源性较高的序列gene10,将其克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pUV15tetORm后,在耻垢分枝杆菌mc2155中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE检测,对诱导培养菌进行混浊度测定、透射电镜观察以鉴定其裂解活性。将gene10克隆入pET28a,pQE80L大肠杆菌表达质粒,通过克隆位点的选择分别构建不含标签的pET28-gene10重组子和含His-tag标签的pQE80-gene10重组子,为噬菌体D29裂解酶在工程菌中的表达做准备。5.TMHMM软件分析裂解酶基因相邻ORF,将有预测跨膜序列的开放阅读框gene11作为假定穿孔素基因,PCR法扩增其全长序列,将其克隆入pQE80L载体并在大肠杆菌M15中诱导其表达,对诱导培养菌进行混浊度测定,鉴定其裂解活性。结果:1.DV40气溶胶发生器发生6×109PFU/ml噬菌体D29气溶胶后,其在暴露系统的气溶胶总粒子平均空气动力学直径为0.860±0.017μm, Andersen二级采样器采样1h后采样皿无噬菌体生长,说明无噬菌体气溶胶泄漏。双层琼脂培养计数法测定采样液的噬菌体平均含量为1.52×108±5.41×107PFU,实时荧光定量PCR测得的平均含量为4.33×108±4.27×107PFU,两种测量方法间无差异(P>0.05)。通过采样液噬菌体D29含量计算出噬菌体D29气溶胶在暴露腔内浓度为6.19×109PFU/m3,豚鼠噬菌体D29气溶胶理论吸入剂量为2.38×105PFU。2.根据噬菌体D29暴露豚鼠1h后的数据资料分析,气溶胶途径暴露动物,动物噬菌体呼吸系统总摄入量与暴露剂量无差别(P>0.05),肺部噬菌体摄入量与暴露剂量无差别(P>0.05),肺部噬菌体摄入量高于气管摄入量(P<0.05)。滴鼻暴露途径动物噬菌体摄入量低于暴露剂量(P<0.0001),肺部噬菌体摄入量高于气管摄入量(P<0.05)。3.对噬菌体D29暴露豚鼠1h、8h、24h的双层培养计数和荧光定量PCR检测的结果进行比较分析,1h时两种方法测得的噬菌体数无差别(P>0.05),说明噬菌体还完全存活无明显死亡;8h、24h时,培养计数法噬菌体数低于定量PCR法(P<0.05),表明活噬菌体和总噬菌体有显著差异。计算气溶胶组各时间点噬菌体在动物肺脏的失活率和清除率结果为:8h时噬菌体失活率99.19%,清除率27.08%;24h时噬菌体失活率99.99%,清除率95.19%。4.噬菌体D29重复暴露豚鼠实验结果表明,在重复暴露5周的过程中,包括生理盐水滴鼻、生理盐水气溶胶暴露途径在内的豚鼠均有较高的死亡率(20%～100%),综合存活豚鼠体重增长、脏器病变和病理组织学观察结果,豚鼠的肺脏发生明显病变,导致豚鼠呼吸功能受到影响,出现死亡。但各组间的各项指标比较结果无统计学差异(P>0.05)。5.噬斑减少中和抗体实验结果显示7H9培养基及生理盐水对照组豚鼠血清无噬菌体D29中和抗体产生;D29气溶胶组和D29滴鼻组在第7天产生低效价的中和抗体,第14天抗体效价下降,第21天之后无抗体产生;注射组产生了稳定的中和抗体,在第14天效价短暂下降后呈逐周递增趋势。各组动物血清中IL-2、IL-4、IFN-γ含量的检测结果表明,各实验组动物血清的以上三种细胞因子含量与7H9培养基对照组、生理盐水对照组相比均无明显差异(P>0.05)。6.通过酶切鉴定,成功构建了重组穿梭质粒pUV-gene10并使gene10在耻垢分枝杆菌中获得表达,表达产物能有效降低宿主菌培养液混浊度,透射电镜观察结果大部分宿主菌细胞壁不完整,细胞质流失,大量细胞破碎或形成空泡状结构。7.通过酶切鉴定,成功构建了pET28-gene10、pQE80-gene10原核表达重组质粒。8.通过酶切鉴定,成功构建了大肠杆菌原核表达重组子pQE80-gene11并转化入大肠杆菌M15中,宿主菌诱导培养后吸光度的检测结果表明gene11表达产物具有明显的裂菌活性。结论:1.气溶胶途径具有高效的输送效率,绝大多数噬菌体D29气溶胶被直接输送入肺结核病的病灶区——肺部,并至少在1h内保持生物活性;2.气溶胶途径、滴鼻途径引起的抗体中和反应明显轻于皮下注射途径;3.噬菌体D29治疗、气溶胶途径给药的安全性有待进一步验证;4.噬菌体D29的裂解酶基因为gene10,穿孔素基因为gene11;5.成功构建了噬菌体裂解酶基因gene10的原核表达载体pET28-gene10、pQE80-gene10。噬菌体D29气溶胶途径给药,有输送效率高,活性损伤小,引发免疫反应轻等特点,其在抗耐药结核菌治疗方面的应用值得期待;噬菌体D29裂解酶及穿孔素基因的鉴定为噬菌体裂解机制的研究、裂解酶应用于抗耐药结核菌治疗的研究奠定了基础。目前国内外无噬菌体D29气溶胶给药及噬菌体D29裂解功能基因的报导,本研究具有一定的创新性。