性别的出现是生物进化史上重大的进步之一,性别决定机理研究是科学研究的焦点之一。随着科学技术的进步,哺乳动物基因决定性别学说因SRY基因的发现,而逐渐被人们接受。然而鸟类性别决定和分化过程与哺乳动物存在很大差异,虽然鸟类的Z和W染色体上都发现了与性别决定相关的基因,但是并没有类似哺乳动物起决定作用的SRY基因。有趣的是自然条件下牝鸡司晨的性反转现象在史书上也早有记载,研究者也发现鸡的性别决定和分化过程容易受到性激素变化的影响。由于性反转鸡是研究鸟类性别决定和分化的理想模型,以及其潜在经济价值,近年来研究者们尝试各种方法研究性反转鸡。本实验室对诱导产生雄性表型性反转鸡有着丰富的经验,已经具备成熟的性腺摘除手术,并能够通过激素诱导获得雄性表型性反转鸡。但面临的问题有:雄性表型性反转鸡的反转性状不稳定,雄性表型性反转鸡输精管发育是否完善。对此,本研究使用依西美坦(芳香化酶抑制剂)+睾酮两种药物单独或联合用药分别处理种蛋,在小鸡孵出后第3~5d摘除性腺,并交叉分组继续药物跟踪诱导。观察雄性表型性反转鸡表观性状的变化,在鸡长到1月龄的时候取血量丰富的副羽毛囊组织通过PCR验证鸡的遗传性别,并分别在1月龄,2月龄,3月龄,4月龄取性腺,通过实时荧光定量PCR测定鸡性别决定相关基因在性腺内表达的情况,6月龄时观察精子形成和输精管发育情况。此外本研究通过体外人工授精探索雄性表型性反转鸡精子的可育性。实验分为A、B、C、D 4个组,其中A和B组在鸡胚中注射依西美坦,C和D组在鸡胚中注射依西美坦+睾酮;实验鸡出雏后A和C组注射依西美坦+睾酮,B和D组注射依西美坦。结果如下:`注射0.7mg依西美坦与注射0.7mg依西美坦+0.5mg睾酮均显著降低种蛋孵化率,分别在孵化前期和出雏期造成死亡高峰,最终出雏率都低于40%,说明依西美坦对胚胎发育有较强的毒性。并且添加睾酮处理组中,出壳的雏鸡中,弱雏率显著高于只添加依西美坦组,说明过量睾酮不利于胚胎发育。1月龄的鸡比较,A、B、C和D组鸡冠、肉髯发育比对照组更突出,而尾巴形状和好斗的性格则是A和C组更接近对照组。A,C组睾丸发育,除了体积略小于对照组,形状,色泽都与之相似;B,D组睾丸在1月龄和2月龄时形状与对照组相似,但外表开始变得不光滑,颜色不均匀,3月龄的性腺表面粗糙,颜色粉白,没有继续长大的趋势,4月龄时成淡白色片状,边缘不规则。表明单独使用依西美坦跟踪诱导不能得到表型稳定的雄性表型性反转鸡,而使用依西美坦中添加睾酮的混合药剂跟踪诱导,能使雄性表型性反转鸡稳定表现雄性形状。DMRT1、SF1、DAX1、AMH、SOX9和P450arom基因在雄性表型性反转鸡性腺中均有表达,且组间差异随日龄增长逐渐增大。其中DMRT1、AMH和SOX9基因随鸡日龄表达增加,在A、C组和对照组中的表达相对于B、D组差异越来愈大,到4月龄时,相对表达量差异显著。睾酮能上调DMRT1、AMH和SOX9基因,下调SF1、DAX1和P450基因在雄性表型性反转鸡性腺的表达,表明DMRT1、AMH和SOX9基因与睾丸的形成紧密相关。6月龄A组雄性表型性反转鸡表观雄性性征明显,打鸣声音洪亮。解剖可见蚕豆状(长3.06厘米,宽1.22厘米,重3.83克)黄白色睾丸,紧致饱满,输精管形态良好。显微镜下可见大量鞭毛样游动精子,睾丸切片可见大量排列致密的曲精细管,管壁中的支持细胞和各级生精细胞分化良好,排列规则,并有大量精子。输精管切片中,近睾丸段切片中能看到大量精子存在;输精管中段切片管壁变厚,管腔逐渐变细,精子量减少;远睾丸段输精管管腔逐渐缩小被实质填充。表明A组雄性表型性反转鸡能够维持稳定雄性性征,并能够产生精子,但是输精管在6月龄时发育仍不完善,其能否随年龄增大后通过自然交配得到下一代尚待进一步研究。总结:(1)使用依西美坦和睾酮联合诱导能够获得表型稳定的性成熟雄性表型性反转鸡。性成熟性反转鸡输精管前段发育完整,但是输精管末端管腔实质性堵塞。(2)睾酮能上调DMRT1、AMH和SOX9基因,下调SF1、DAX1和P450arom在雄性表型性反转鸡性腺的表达,表明DMRT1、AMH和SOX9基因与睾丸的形成紧密相关。