鼠疫是一种发病急、传播快、病死率高、传染性强的自然疫源性烈性传染病,是危害人类最严重的烈性传染病之一,属国际检疫传染病,在我国《传染病防治法》中列为甲类传染病之首。历史上鼠疫有三次大流行,均导致超过一千万人以上的死亡,被称为黑死病。在自然界,鼠疫主要感染啮齿类动物,通过跳蚤叮咬传染至人类。鼠疫的病原体是耶尔森氏菌。鼠疫菌侵入机体后,首先被局部淋巴组织中的吞噬细胞所吞噬,大部分的细菌被吞噬细胞杀死,但是仍有部分被巨噬细胞吞噬的鼠疫菌能通过某些机制得以存活和繁殖,并最终裂解细胞释放到机体微环境中。从巨噬细胞释放出来的鼠疫菌可以沿淋巴流到达局部淋巴结,甚至并转移至血液和全身脏器中,进而形成高致死性的败血症型鼠疫和肺鼠疫。对鼠疫菌致病分子机制的研究将有助于鼠疫的防治。鼠疫菌的Ⅲ型分泌系统(TypeⅢ secrtion system,T3SS)是鼠疫菌致病的重要因素。T3SS系统是革兰氏阴性菌中广泛存在的重要毒力因子,主要包括装置蛋白、毒力蛋白、伴侣蛋白和转位子蛋白。其中毒力蛋白通过装置蛋白被分泌到细胞外或宿主细胞表面。甚至直接“注射”到宿主细胞中。鼠疫菌主要有6种效应蛋白：YopH, YopE, YopT, YopJ/P, YpkA和YopM,这些效应蛋白对鼠疫菌的毒力起到至关重要的作用。其中,YopM在感染宿主过程中尤为关键,当YopM缺失突变,鼠疫菌的致病性大大降低。我们前期实验表明,YopM能够促进IL-1β分泌甚至“细胞焦亡”,并且通过生物信息学预测,YopM可能是个新型的E3连接酶。然而,YopM作为鼠疫菌内非常重要的毒力因子,其宿主靶标和致病具体机制的尚不清楚。因此本研究拟通过实验研究确定YopM的E3连接酶活性及其底物,进一步研究YopM的E3连接酶活性对鼠疫菌致病性的影响。我们研究表明：YopM特异性靶向NALP3蛋白,与NALP3相互作用并介导NALP3发生K63位泛素化连接,从而调控NALP3炎症小体的炎症反应。虽然炎症反应能够抵御细菌和病毒感染,维持细胞的存活,起到保护宿主清除鼠疫菌等致病菌的入侵,但是炎症的过度激活,导致细胞焦亡,导致肠上皮细胞屏障破坏,细菌进一步扩散。因此,我们推测YopM可以调控炎症小体组成蛋白NALP3蛋白稳定性并对其进行泛素化修饰作用,这是调控宿主抗病原菌应答一种新的机制。进一步研究表明：1、YopM在参与炎症小体的调控中起到至关重要的作用：通过鼠疫菌感染小鼠骨髓巨噬细胞BMDM,发现野生型鼠疫菌导致procaspase-1激活并促进IL-1β分泌,YopM缺失突变的菌株激活炎症小体的功能明显减弱。2、YopM是个新型的E3连接酶：通过体内和体外自身泛素实验,证实YopM具有E3连接酶活性。通过序列分析、构建CA突变体,发现YopM通过其N端的第68位半胱氨酸发挥E3连接酶功能。3、YopM通过影响NALP3稳定性调控炎症小体的激活：通过免疫共沉淀实验发现YopM能够与NALP3相互作用,进一步免疫印迹实验表明YopM通过E3连接酶使NALP3发生K63位泛素化连接,增强NALP3的稳定性并延长其半衰期。4、YopM调控NALP3炎症小体介导的抗病原菌细胞应答：通过鼠疫菌感染BMDC细胞并检测其毒力,发现YopM缺失突变的鼠疫菌侵染巨噬细胞的毒力大大降低,YopM C68A回复突变株不能同YopM回复突变株一样恢复其强毒力。综上所述,本研究发现YopM作为新型E3连接酶,通过其N端的68位半胱氨酸催化Nalp3发生K63-连接的泛素化修饰,并与NALP3发生相互作用,增强Nalp3稳定性、延长其半衰期,并最终促进NALP3炎症小体的激活。本研究确定了YopM的致病机制,揭示了鼠疫菌致病的分子机理,为鼠疫的防治和鼠疫疫苗等的开发应用提供新的靶标。