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研究背景流感病毒（influenza virus）是一种能够引起严重呼吸道传染性疾病的RNA病毒，属正粘病毒科。根据其内部核蛋白（NP）和基质蛋白（M）的抗原性不同，流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三种类型，其中，甲型流感病毒又根据HA分为17种亚型，NA分为9种亚型，能组成153个血清型甲型流感病毒。甲型流感病毒在上个世纪曾引起三次大范围的流行，2009年新型甲型H1N1流感病毒在214个国家爆发流行，2013年3月底，一场突来的由H7N9引起的禽传染人流感让这个春天骤然紧张起来，再次突显了甲型流感病毒感染的严重性。接种疫苗是预防流感发生与传播的最有效的手段，目前批准上市的甲型流感疫苗主要有四种：全病毒灭活疫苗、裂解疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗。这些疫苗都对同亚型甲型流感病毒感染预防有效，但在不同亚型甲型病毒之间的保护效果较弱甚至没有。此外，甲型流感病毒的变异速度非常快，疫苗每年都需更换，给疫苗的生产制备造成诸多不便。世界卫生组织（WHO）依据当年全世界范围流感病毒变化情况来预测并推荐下一年流感疫苗生产所用组分，预测准确度将会直接影响疫苗的保护效率，若预测失败将会造成流感爆发流行的潜在威胁。因此，通用型甲型流感疫苗的研究迫在眉睫。通用型甲型流感疫苗研究的靶点主要集中在HA的保守片段、M2e和内部蛋白NP和M1上，最初人们关于通用型甲型流感疫苗的研究主要基于M2e和HA的保守部位，但是M2e和HA提供的交叉保护不够全面，不能满足人们对通用型流感疫苗的要求，至今仍无批准上市的通用型流感疫苗，越来越多的研究开始瞄准甲型流感病毒中高度保守的NP和M1蛋白。甲型流感病毒特异的T细胞反应具有广泛的跨亚型保护作用，日益引起研究的关注。而诱发此类特异T细胞反应的主要是病毒内部的NP和M1蛋白。热休克蛋白HSPs（Heat shock proteins），如HSP60，HSP70和gp96的，可直接作用于抗原提呈细胞（antigen-presenting cell,APC），也可作为链接先天免疫和获得性免疫的纽带。我们首次选择基于NP和M1蛋白，以热休克蛋白60（Heat shock protein60，HSP60）为分子内佐剂的通用型甲型流感疫苗研究。目的本研究的目的是克隆、表达并纯化重组NP-M1-HSP60融合蛋白，免疫BALB/c小鼠，评价其免疫原性及免疫保护性，为候选通用流感疫苗抗原提供新靶标，为发展安全、有效、具有广泛保护作用的通用型甲型流感疫苗奠定基础。方法与结果第一部分候选通用型甲型流感疫苗免疫生物信息学分析及分子设计通过BLAST在线分析，选取了流感病毒A/Panama/2007/1999株的NP和M1序列为模板序列，成功设计了以GGGPGGG为linker连接NP、M1、HSP60组成重组基因NP-M1和NP-M1-HSP60的模式。通过软件Protean程序及在线蛋白质分析系统ExPASy，对蛋白NP、M1、HSP60及重组蛋白NP-M1、NP-M1-HSP60进行基本理化性质、柔性、亲水性、表位、二级结构等进行分析，验证了NP-M1和NP-M1-HSP60重组抗原作为通用型流感疫苗抗原的合理性。第二部分候选通用型甲型流感疫苗抗原的表达、纯化及鉴定通过基因工程方法，构建并鉴定获得pET28a-NP-M1-HSP60、 pET28a-NP-M1及pET28a-HSP60重组表达质粒，转化E.coli BL21(DE3)细胞，IPTG诱导表达。在37℃的温度条件下获得了以包涵体形式表达为主的重组蛋白NP-M1-HSP60、NP-M1和HSP60。经温度条件优化，在26℃的温度条件下获得了以可溶性表达的重组蛋白NP-M1-HSP60、NP-M1和HSP60。采用层析方法获得纯化的重组蛋白NP-M1-HSP60、NP-M1和HSP60。Western Blot检测证明重组蛋白NP-M1-HSP60、NP-M1和HSP60具有免疫活性。经SDS-PAGE鉴定纯化得到了纯度＞85%的目的蛋白。第三部分候选通用型甲型流感疫苗免疫原性和保护性的初步评价测定纯化后目的蛋白的浓度，与SP01水包油乳剂佐剂等体积混合后，以10μg为免疫剂量，喷鼻途径免疫小鼠。采用间接ELISA、ELISOPT等方法对疫苗在BALB/c小鼠体内的免疫原性及免疫保护效果进行评价。结果显示，候选流感通用疫苗可以诱导产生较强的体液及细胞免疫应答，IgG亚型分析及ELISPOT结果表明该候选疫苗可诱导相对均衡的Th1和Th2反应，并且能够产生黏膜局部免疫应答。随后，用甲型流感病毒A/Beijing/501(H1N1)株、A/PR/8/34(H1N1)株和A/Ostrich/Suzhou/097/2003(H5N1)株进行致死性攻击后，疫苗免疫组的保护率分别为100%、100%和67%，并能降低小鼠肺组织的病理损伤和小鼠组织病毒滴度。以上结果表明，基于NP和M1通用型甲型流感疫苗具有良好的免疫原性和交叉保护作用。结论本研究采用大肠杆菌表达系统，成功制备了基于流感病毒NP和M1蛋白的候选通用型甲型流感疫苗抗原，并进一步进行了免疫原性和免疫保护效果评价。实验结果显示，该抗原具有很好的免疫原性，可以刺激机体产生体液免疫应答、细胞免疫应答和黏膜局部免疫应答，并且能产生有效的免疫保护效果，为通用型甲型流感疫苗的深入研究奠定了基础。