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氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)含有多种膜结合脱氢酶,可不完全氧化多种醇、醛等化合物生成相应的醛、酮和酸,该特性使其作为生物催化剂广泛应用于生物合成工业。利用基因工程手段在G.oxydans中过表达某种脱氢酶基因,可在很大程度上增加单位菌体的催化效率,提高相关产物的产量。然而,目前适用于G.oxydans的基因表达载体的拷贝数普遍较低,这严重限制了它在工业生产中的应用潜力。本课题以普遍用于G.oxydans中基因表达的广宿主质粒pBBR1MCS-5为基础,利用基因定点突变技术构建了6种在G.oxydans DSM2003中拷贝数提高的载体,并用突变后的载体构建了一株高产2-酮基-D-葡萄糖酸(2KGA)的菌株。 首先,利用基因定点突变技术突变质粒pBBR1MCS-5中与质粒复制相关的rep基因的上游调控区,获得了6种可成功在G.oxydans DSM2003中稳定存在的质粒,命名为pBBR-10、pBBR-35、pBBR-3510、pBBR-RBS、pBBR-R35、pBBR-R31;并运用Q-PCR测定了它们在G.oxydans DSM2003中的拷贝数,发现均比亲本质粒pBBR1MCS-5有不同程度地提高。为了验证这些质粒的应用能力,插入报告基因GFP,发现用这些突变质粒在G.oxydans DSM2003中表达GFP后菌体均有绿色荧光产生,说明这些质粒均可用于在G.oxydans DSM2003中进行基因表达。 然后,将所获得的6种突变质粒在G.oxydans DSM2003中过表达编码催化葡萄糖酸(GA)生成2KGA的关键酶基因ga2dh,构建高产2KGA的工程菌。通过对过表达菌中ga2dh基因转录水平的测定,以及在摇瓶中催化反应速率的测定,筛选到一株2KGA高产菌G.oxydans/pBBR-3510-ga2dh。7L发酵罐中的转化实验表明,30g/l的G.oxydans/pBBR-3510-ga2dh细胞(湿重)可在17h内将320g/l GA完全转化为约320 g/l的2KGA,时空产率达到18.86g/l/h,为野生菌的2.84倍,为亲本质粒过表达菌的1.60倍。当将底物浓度提高到480 g/l时,30 g/l细胞(湿重)可在45 h内将底物完全消耗,产生约486 g/l的2KGA,时空产率达到10.80g/l/h,超过目前文献报导的最高水平。