肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一类引起人和初生动物患病的重要病原菌。人或动物被ETEC感染后,常因严重腹泻和脱水而死亡,发病率和死亡率都很高,给养殖业和食品安全领域带来严重的经济损失。本实验从150份市售猪肉样品和养殖场猪粪中分离ETEC,通过生理生化指标和分子生物学手段鉴定该菌株,利用特异性引物分离ETEC单菌落并进行纯化,以分离得到的单菌落为宿主菌,筛选裂解性噬菌体,然后考察噬菌体的生物学特性,为噬菌体的应用奠定基础。将猪肉样品用均浆机打碎并稀释,猪粪样品预处理后在脑心浸出液肉汤中增菌,然后涂布于选择性培养基麦康凯中培养,观察菌落形态。分离纯化后的优势菌菌落颜色为桃红色,菌落形态呈表面隆起、边缘整齐、光滑、圆润等特征。然后,提取混合菌液的总DNA,用设计合成的5种引物和探针,进行MRT-PCR反应,对于阳性样品保留作下一步的实验;将PCR扩增获得的16S rDNA片段(1436bp)进行系统发育树分析表明与大肠杆菌属有99%的同源性,可以判定为大肠杆菌属。对阳性混合菌液中的疑似ETEC进行生理生化鉴定,分离的致病菌具有运动性,能够分解代谢鸟氨酸、赖氨酸、色氨酸、尿素、苯丙氨酸、甘露醇、肌醇、蜜二糖、棉子糖,不能分解代谢山梨醇、核糖醇。利用LT基因、ST基因的引物进行特异性PCR反应,从阳性混合菌样品中分离ETEC单菌落并纯化,对分离得到的ETEC进行耐药性分析以及外膜囊泡的分离鉴定,进一步验证其特征。结果表明,150个猪源样品中共分离得到7株ETEC,其中3株只携带LT基因,2株只携带ST基因,2株既携带LT基因又携带ST基因,可以初步判定其中2株既携带LT基因又携带ST基因的ETEC的致病性比其他菌株强。对分离得到的ETEC进行耐药性分析,选择10种常用的抗生素,检测ETEC菌株的耐药性,结果表明,ETEC对环丙沙星、复方新诺明、阿莫西林极度敏感,对链霉素、四环素高度敏感,对氯霉素、多西环素中度敏感,对多粘菌素B和庆大霉素产生抗性。采用超滤离心法分离ETEC产生的外膜囊泡,并用透射电镜进行观察。结果显示,ETEC的外膜囊泡约为100 nm,呈圆形或椭圆形。利用两株既携带LT基因又携带ST基因的ETEC-1和ETEC-2作为宿主菌,采集养殖场和医院的废水,经离心、过滤等处理得到ETEC-1的噬菌体原液;将噬菌体原液接种到对数生长期菌液中培养,过滤除菌,得到高效价噬菌体增殖液。通过双层平板法分离纯化得到两株噬菌体,命名为PES-1和PES-2。透射电镜观察结果显示,分离的两株噬菌体(PES-1和PES-2)属于长尾科噬菌体(Siphoviridae)。通过体外抑菌实验、一步生长曲线、pH、温度稳定性、氯仿敏感性实验,以及噬菌体颗粒浓缩来确定噬菌体的生物学特性。提取噬菌体基因组DNA,进行酶切反应,参与酶切的限制性内切酶:Xho I、EcoR I、Bam H I、HindIII。酶切实验表明,PES-1的基因组为线性DNA,PES-2的基因组DNA为环形。PES-1的裂解能力优于PES-2,PES-1和PES-2共同作用时,可以显著抑制病原菌的生长。将SDS和胆盐按照不同的浓度梯度加入噬菌体与宿主菌中,测定其菌液的OD600的值,与只加噬菌体和只加抗生素的空白对照组作对比,结果表明,SDS和胆盐都使噬菌体的裂解能力有不同程度的下降;如果将噬菌体口服灌胃施用,胆盐作为哺乳动物肠道内分泌物,噬菌体必会受到胆盐的影响,因此,噬菌体口服施用时应包被。噬菌体—抗生素联合应用是控制耐药菌感染、控制菌株抗性进化的有效方法。将不同浓度的阿莫西林,链霉素和庆大霉素与噬菌体共同作用于ETEC,测定菌液OD600的值,结果表明,噬菌体与阿莫西林,链霉素,庆大霉素联合使用的抑菌效果呈协同效应。