胃癌是发病率死亡率均较高的恶性肿瘤之一,严重地危害着国人的健康。深入了解胃癌的发病机制、发展过程,将有助于早期发现、合理制定治疗方案、正确判断患者预后,并为其它恶性肿瘤的基础与临床研究提供线索和参考。但是,胃癌的发生机制十分复杂,是一个多因素参与、多阶段的演变过程,除了环境因素外,亦涉及各种癌基因的激活、抑癌基因的失活等分子遗传学改变。近年来,一些发挥重要作用的胃癌相关基因相继被发现,但仍然无法解释所有的胃癌发生事件,提示在胃癌发生发展过程中还有其它的分子机制尚未被揭示。　　 前期实验中,我们检测了4号染色体长臂的杂合性丢失情况。结果显示,最小丢失区域位于4q33,此区域丢失频率也最高,为65%,并且与肿瘤的进展程度显著相关。进而,我们利用癌症基因组解剖计划的在线基因表达系列分析文库与分析工具,对此区域内所有的基因进行了表达谱的对照分析。结果发现只有AnnexinA10(ANXA10)基因在胃癌细胞中的表达显著地低于正常胃粘膜细胞。提示,ANXA10可能是该区域内与胃癌发生、发展密切相关的候选抑癌基因。　　 Annexins(ANXs)是一类Ca2+依赖磷脂结合蛋白,在机体多个生理和病理过程中发挥重要的作用,如胞吞和胞吐作用、细胞分裂、凋亡、Ca2+信号传导、免疫抑制、血管生成等。目前已发现一些ANXs蛋白与肿瘤存在密切关系。作为1999年才被克隆的新成员,ANXA10的生物学功能还有待发掘。有研究证明,肝癌中ANXA10 mRNA的表达显著下调,在中晚期肝癌中更为明显,并且与早期复发、转移和预后不良密切相关。另外,经三氧化二砷(As2O3)作用后的多发骨髓瘤细胞株U266内ANXA10的表达显著上调。这些现象都反映了ANXA10与抑制肿瘤生长之间的潜在联系。　　 然而,有关ANXA10与胃癌发生、发展关系的研究仍未见报告。为此,本研究拟采用免疫组化及实时定量PCR法检测ANXA10在胃癌原发灶、相应癌旁非癌组织中的表达水平,并探讨其表达水平与胃癌临床病理特点的相关性;采用真核表达载体及RNA干扰载体,通过靶向ANXA10在细胞内表达,构建ANXA10高表达和低表达胃癌细胞系,探讨ANXA10不同表达水平条件下细胞生长、迁徙、侵袭能力的差异;采用聚合酶链反应结合聚丙烯酞胺凝胶电泳、硝酸银染色方法比较胃癌组织与其癌旁正常组织ANXA10基因区域微卫星多态标记物的杂合性缺失情况,并采用变性高效液相色谱技术联合DNA测序技术检测AXNA-10基因在胃癌中的突变模式,以期明确候选抑癌基因ANXA10在胃癌中表达异常的分子机制。研究结果将为胃癌诊断特异性标志物的筛选提供依据,并为今后胃癌综合治疗提供靶点。　　 方法　　 1、ANXA10在胃癌中的表达及临床意义　　 采用免疫组化法检测145例胃癌组织及癌旁5cm以外经病理学证实的非癌组织ANXA10蛋白表达情况,并与临床病理学指标比较;　　 采用实时定量PCR法检测75例胃癌组织及癌旁5cm以外经病理学证实的非癌组织ANXA10 mRNA表达情况,并与临床病理学指标比较。　　 2、ANXA10表达对胃癌细胞生物学行为的影响　　 利用实时定量PCR技术分别检测SGC-7901、BGC-823、MGC-803、MKN-45、MKN-28、MKN-1胃癌细胞系及GES-1正常胃粘膜细胞系中ANXA10表达情况,筛选表达水平较低和较高的胃癌细胞系作为后续研究对象;　　 利用分子克隆方法构建ANXA10逆转录病毒载体,并进行酶切及测序鉴定;　　 利用生物信息学技术设计靶向ANXA10基因的shRNA,构建表达荧光素酶的干扰载体,并进行测序鉴定;　　 采用ANXA10逆转录病毒载体pLXSN-ANXA10感染ANXA10表达水平较低的胃癌细胞系MKN-1细胞,筛选获得稳定转染克隆,并鉴定ANXA10表达上调情况;　　 采用ANXA10干扰载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA10转染ANXA10表达水平较高的胃癌细胞系BGC-823细胞,筛选获得稳定转染克隆,并鉴定ANXA10表达抑制情况;　　 采用MTT实验检测上调/下调ANXA10基因表达前后,MKN-1/BGC-823细胞增殖能力的改变;　　 采用划痕试验检测上调/下调ANXA10基因表达前后,MKN-1/BGC-823细胞迁徙能力的改变;　　 采用Transwell侵袭实验检测上调/下调ANXA10基因表达前后,MKN-1/BGC-823细胞侵袭能力的改变。　　 3、候选抑癌基因ANXA10表达下调机制的研究　　 获取本课题组以往研究中经激光捕获微切割技术切取的56例胃癌癌旁正常胃粘膜组织和原发癌灶组织。全部标本经常规技术提取DNA后,按照Genomiphi WGA Kit说明书进行全基因组多重置换扩增,扩增样本于-80℃冰箱冻存;　　 采用聚合酶链反应结合聚丙烯酞胺凝胶电泳、硝酸银染色方法比较上述样本胃癌组织与其癌旁正常组织ANXA10基因区域微卫星多态标记物的杂合性丢失情况;　　 采用变性高效液相色谱技术联合DNA测序技术检测上述样本AXNA10基因在胃癌中的突变模式。　　 结果　　 1、ANXA10在胃癌中的表达及临床意义　　 (1)免疫组化法检测ANXA10蛋白表达水平与胃癌临床病理特点的关系:ANXA10定位在胞浆和胞核,其在胃癌原发灶中的表达阳性率为49.7%,显著低于癌旁非癌组织的98.6%。ANXA10低表达与肿瘤部位、浸润深度、淋巴结转移密切相关。ANXA10表达阳性病例5年生存率可达53.4%,而ANXA10表达阴性患者的5年生存率仅为23.4%,两者差异显著。　　 (2)实时定量PCR检测ANXA10 mRNA表达水平与胃癌临床病理特点的关系:实时定量PCR检测ANXA10 mRNA表达水平显著低于其配对癌旁非癌胃粘膜组织。75例胃癌组织中,64.0%的病例ANXA10 mRNA表达水平低于癌旁非癌胃粘膜表达水平的2倍以上。ANXA10 mRNA低表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移密切相关。　　 2、ANXA10表达对胃癌细胞生物学行为的影响　　 (1)ANXA10在胃癌细胞系中表达水平:ANXA10基因在5个胃癌细胞株中的表达显著下降,包括MKN-1、MKN-45、MKN-28、MGC-803、SGC-7901,而只在胃癌细胞株BGC-823及正常胃粘膜细胞株GES-1中表达较高。　　 (2)ANXA10过表达及表达抑制对胃癌细胞增殖、迁徙、侵袭能力的影响:与未转染载体的MKN-1胃癌细胞与转染空载体pLXSN-NC的MKN-1胃癌细胞相比,稳定转染pLXSN-ANXA10的2号、6号细胞克隆的增殖能力、迁徙能力及侵袭能力明显降低;与未转染载体的BGC-823胃癌细胞与转染空载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC的BGC-823胃癌细胞相比,稳定转染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA10-626、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA10-850的BGC-823细胞的增殖能力、迁徙能力及侵袭能力明显增强。　　 3、候选抑癌基因ANXA10表达下调机制的研究　　 (1)ANXA10基因区域微卫星多态标记物的杂合性丢失结果:56例胃癌中,5例在3个位点(D4S1502、D4S2368、和"ACTC"四核苷酸重复)均显示为纯合子,为无信息样本,在本实验中不予分析;其余51例胃癌DNA中共有16例(31%)存在1个或多个位点的杂合性丢失,其中有6例在两个位点存在杂合性丢失。ANXA10基因所在区域的杂合性丢失与ANXA10蛋白表达下调密切相关。　　 (2)AXNA10基因在胃癌中的突变模式:通过检测56例胃癌组织ANXA10全部12个外显子,没有检测到突变,只发现了2例已知的单核苷酸多态位点,分别为位于第6外显子的c589G＞A(rs4405979)和位于第7外显子的c649G＞A(rs477897)。　　 结论　　 ANXA10在胃癌组织中显著低表达。ANXA10蛋白表达下降与肿瘤部位、浸润深度、淋巴结转移高度相关。ANXA10 mRNA低表达与浸润深度、淋巴结转移密切相关。生存分析表明ANXA10低表达与胃癌患者不良预后密切相关,提示ANXA10在胃癌的发生发展过程中可能发挥了重要作用,可以作为胃癌诊断与预后判断的一个新的标记物。　　 稳定表达ANXA10后,低表达ANXA10的胃癌细胞系MKN-1细胞增殖、迁徙及侵袭明显降低;稳定干涉ANXA10表达后,高表达ANXA10的胃癌细胞系BGC-823细胞增殖、迁徙及侵袭能力明显增加;因此,ANXA10低表达与胃癌细胞增殖、迁徙和侵袭密切相关。重新表达ANXA10可以部分逆转肿瘤细胞的恶性表型。ANXA10基因有望成为胃癌综合治疗的靶点之一。　　 ANXA10基因区域杂合性丢失状态与ANXA10低表达水平密切相关,可能是ANXA10基因失活的机制之一。但是,仍有其它机制参与了ANXA10基因失活,有待于今后进一步研究阐明。