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研究背景：
乳腺癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因，化疗在其综合治疗中占有十分重要的地位。紫杉醇(paclitaxel, Taxol)作为乳腺癌基础化疗药物之一，有很好的疗效。随着Taxol的广泛应用，越来越多的患者出现耐药。因此，研究Taxol耐药的机制并寻找可逆转耐药的方法，对提高乳腺癌化疗疗效具有非常重要的意义。双硫仑(disulfiram, DSF)是一种古老的抗酒精中毒的药物，它与金属铜(cuprum, Cu)螯合形成的络合物(DSF-Cu)能够增强化疗药物毒性并逆转耐药。MCF-7细胞是激素受体(hormone receptor, HR)阳性表达的乳腺癌细胞亚型，目前关于DSF-Cu对耐Taxol的乳腺癌MCF-7/Taxol细胞的作用和机制还未曾报道。
研究目的：
本研究将通过对乳腺癌MCF-7细胞在Taxol干预下和MCF-7/Taxol细胞在DSF-Cu干预下凋亡和自噬等相关分子指标的变化进行研究，研究结果将阐明MCF-7细胞Taxol获得性耐药和DSF-Cu对MCF-7/Taxol细胞的作用机制，为Taxol和DSF更好应用于乳腺癌临床治疗提供更坚实的理论基础。
研究方法：
1.通过细胞培养技术培养MCF-7和MCF-7/Taxol细胞，在倒置显微镜下观察两种细胞的形态和生长状况；通过CCK-8法分析MCF-7/Taxol细胞耐药性；通过qRT-PCR法测MCF-7和MCF-7/Taxol细胞中Bcl-2、Bax和Beclin-1基因的表达；通过WesternBlot法测MCF-7和MCF-7/Taxol细胞中Bcl-2、Bax和Beclin-1蛋白的表达。
2.通过CCK-8法测MCF-7/Taxol细胞在DSF-Cu干预下的抑制率和存活率，并分析细胞抑制率和存活率与DSF-Cu浓度和作用时间的关系；在倒置显微镜下观察在Taxol和DSF-Cu单药及联合干预下MCF-7/Taxol细胞的生长状况；通过划痕实验观测DSF-Cu对MCF-7/Taxol细胞迁移能力的影响；通过流式细胞凋亡技术测MCF-7/Taxol细胞在DSF-Cu干预下的凋亡率，并分析MCF-7/Taxol细胞凋亡率与DSF-Cu浓度和作用时间的关系。3.通过WesternBlot法测MCF-7/Taxol细胞在Taxol和DSF-Cu单药及联合干预下Bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin-1和CyclinD1蛋白表达的变化。
研究结果：
1.CCK-8结果显示：随着Taxol浓度增高，MCF-7和MCF-7/Taxol细胞抑制率逐渐增高(P<0.05)，存活率逐渐减低(P<0.05)，差异有统计学意义；在相同浓度下，Taxol对MCF-7细胞生长抑制作用比MCF-7/Taxol细胞强(P<0.05)，差异有统计学意义。qRT-PCR结果显示：与MCF-7细胞相比，MCF-7/Taxol细胞Bcl-2和Beclin-1基因的表达增高(P<0.05)，Bax基因的表达减低(P<0.05)，差异有统计学意义。WesternBlot结果显示：与MCF-7细胞相比，MCF-7/Taxol细胞Bcl-2和Beclin-1蛋白的表达增高(P<0.05)，Bax蛋白的表达减低(P<0.05)，差异有统计学意义。
2.CCK-8结果显示：随着DSF-Cu浓度增高，MCF-7/Taxol细胞抑制率逐渐增高(P<0.05)，存活率逐渐减低(P<0.05)，差异有统计学意义；随着DSF-Cu干预时间延长，MCF-7/Taxol细胞抑制率逐渐增高(P<0.05)，存活率逐渐减低(P<0.05)，差异有统计学意义。在倒置显微镜下观察可见MCF-7/Taxol细胞在Taxol和DSF-Cu联合干预下生长状态最差。划痕实验结果显示：在DSF-Cu干预下，MCF-7/Taxol细胞划痕愈合速度较未干预情况下慢(P<0.05)，差异有统计学意义。流式细胞凋亡技术结果显示：在DSF-Cu干预下，随着DSF-Cu浓度增高，MCF-7/Taxol细胞凋亡率逐渐增高(P<0.05)，随着DSF-Cu干预时间的延长，凋亡率逐渐增高(P<0.05)，差异有统计学意义。
3.WesternBlot结果显示：在DSF-Cu和Taxol联合干预下，MCF-7/Taxol细胞Bax和Caspase-3蛋白的表达增高(P<0.05)，Bcl-2、Beclin-1和CyclinD1蛋白的表达减低(P<0.05)，差异有统计学意义。
结论：
1.MCF-7细胞Taxol获得性耐药与Beclin-1/Bcl-2解偶联和Bcl-2/Bax异源二聚体形成有关，在这两种机制的共同作用下Beclin-1和Bcl-2表达增高，Bax表达减低，从而诱导保护性自噬，抑制凋亡，最终导致MCF-7细胞产生Taxol获得性耐药。
2.DSF-Cu能抑制MCF-7/Taxol细胞增殖，其抑制能力在一定条件下与DSF-Cu浓度和干预时间呈正比。DSF-Cu联合Taxol能增强对MCF-7/Taxol细胞的抑制作用。此外，DSF-Cu能抑制MCF-7/Taxol迁移，促进MCF-7/Taxol细胞凋亡。
3.DSF-Cu联合Taxol能通过抑制Beclin-1介导的自噬，阻滞细胞周期G1/S，诱导肿瘤细胞经Bcl-2/Bax途径的凋亡，最终逆转MCF-7细胞Taxol获得性耐药。
乳腺癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因，化疗在其综合治疗中占有十分重要的地位。紫杉醇(paclitaxel, Taxol)作为乳腺癌基础化疗药物之一，有很好的疗效。随着Taxol的广泛应用，越来越多的患者出现耐药。因此，研究Taxol耐药的机制并寻找可逆转耐药的方法，对提高乳腺癌化疗疗效具有非常重要的意义。双硫仑(disulfiram, DSF)是一种古老的抗酒精中毒的药物，它与金属铜(cuprum, Cu)螯合形成的络合物(DSF-Cu)能够增强化疗药物毒性并逆转耐药。MCF-7细胞是激素受体(hormone receptor, HR)阳性表达的乳腺癌细胞亚型，目前关于DSF-Cu对耐Taxol的乳腺癌MCF-7/Taxol细胞的作用和机制还未曾报道。
研究目的：
本研究将通过对乳腺癌MCF-7细胞在Taxol干预下和MCF-7/Taxol细胞在DSF-Cu干预下凋亡和自噬等相关分子指标的变化进行研究，研究结果将阐明MCF-7细胞Taxol获得性耐药和DSF-Cu对MCF-7/Taxol细胞的作用机制，为Taxol和DSF更好应用于乳腺癌临床治疗提供更坚实的理论基础。
研究方法：
1.通过细胞培养技术培养MCF-7和MCF-7/Taxol细胞，在倒置显微镜下观察两种细胞的形态和生长状况；通过CCK-8法分析MCF-7/Taxol细胞耐药性；通过qRT-PCR法测MCF-7和MCF-7/Taxol细胞中Bcl-2、Bax和Beclin-1基因的表达；通过WesternBlot法测MCF-7和MCF-7/Taxol细胞中Bcl-2、Bax和Beclin-1蛋白的表达。
2.通过CCK-8法测MCF-7/Taxol细胞在DSF-Cu干预下的抑制率和存活率，并分析细胞抑制率和存活率与DSF-Cu浓度和作用时间的关系；在倒置显微镜下观察在Taxol和DSF-Cu单药及联合干预下MCF-7/Taxol细胞的生长状况；通过划痕实验观测DSF-Cu对MCF-7/Taxol细胞迁移能力的影响；通过流式细胞凋亡技术测MCF-7/Taxol细胞在DSF-Cu干预下的凋亡率，并分析MCF-7/Taxol细胞凋亡率与DSF-Cu浓度和作用时间的关系。3.通过WesternBlot法测MCF-7/Taxol细胞在Taxol和DSF-Cu单药及联合干预下Bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin-1和CyclinD1蛋白表达的变化。
研究结果：
1.CCK-8结果显示：随着Taxol浓度增高，MCF-7和MCF-7/Taxol细胞抑制率逐渐增高(P<0.05)，存活率逐渐减低(P<0.05)，差异有统计学意义；在相同浓度下，Taxol对MCF-7细胞生长抑制作用比MCF-7/Taxol细胞强(P<0.05)，差异有统计学意义。qRT-PCR结果显示：与MCF-7细胞相比，MCF-7/Taxol细胞Bcl-2和Beclin-1基因的表达增高(P<0.05)，Bax基因的表达减低(P<0.05)，差异有统计学意义。WesternBlot结果显示：与MCF-7细胞相比，MCF-7/Taxol细胞Bcl-2和Beclin-1蛋白的表达增高(P<0.05)，Bax蛋白的表达减低(P<0.05)，差异有统计学意义。
2.CCK-8结果显示：随着DSF-Cu浓度增高，MCF-7/Taxol细胞抑制率逐渐增高(P<0.05)，存活率逐渐减低(P<0.05)，差异有统计学意义；随着DSF-Cu干预时间延长，MCF-7/Taxol细胞抑制率逐渐增高(P<0.05)，存活率逐渐减低(P<0.05)，差异有统计学意义。在倒置显微镜下观察可见MCF-7/Taxol细胞在Taxol和DSF-Cu联合干预下生长状态最差。划痕实验结果显示：在DSF-Cu干预下，MCF-7/Taxol细胞划痕愈合速度较未干预情况下慢(P<0.05)，差异有统计学意义。流式细胞凋亡技术结果显示：在DSF-Cu干预下，随着DSF-Cu浓度增高，MCF-7/Taxol细胞凋亡率逐渐增高(P<0.05)，随着DSF-Cu干预时间的延长，凋亡率逐渐增高(P<0.05)，差异有统计学意义。
3.WesternBlot结果显示：在DSF-Cu和Taxol联合干预下，MCF-7/Taxol细胞Bax和Caspase-3蛋白的表达增高(P<0.05)，Bcl-2、Beclin-1和CyclinD1蛋白的表达减低(P<0.05)，差异有统计学意义。
结论：
1.MCF-7细胞Taxol获得性耐药与Beclin-1/Bcl-2解偶联和Bcl-2/Bax异源二聚体形成有关，在这两种机制的共同作用下Beclin-1和Bcl-2表达增高，Bax表达减低，从而诱导保护性自噬，抑制凋亡，最终导致MCF-7细胞产生Taxol获得性耐药。
2.DSF-Cu能抑制MCF-7/Taxol细胞增殖，其抑制能力在一定条件下与DSF-Cu浓度和干预时间呈正比。DSF-Cu联合Taxol能增强对MCF-7/Taxol细胞的抑制作用。此外，DSF-Cu能抑制MCF-7/Taxol迁移，促进MCF-7/Taxol细胞凋亡。
3.DSF-Cu联合Taxol能通过抑制Beclin-1介导的自噬，阻滞细胞周期G1/S，诱导肿瘤细胞经Bcl-2/Bax途径的凋亡，最终逆转MCF-7细胞Taxol获得性耐药。