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一、研究目的及意义Tao的课题组研究认为：只有在细胞周期调控中的有丝分裂纺锤体组装检验点(SAC)引起的M-arrest(M期阻滞)和M-slippage(有丝分裂跳出)这两个事件都发生后,细胞凋亡才会发生。CDK1抑制剂能够加速已经发生M-arrest的细胞发生M-slippage,并进入不可逆凋亡途径。吴茱萸碱(Evodiamine,EVO)是中药吴茱萸的主要活性物质。课题组前期研究证实：吴茱萸碱有显著的诱导肿瘤细胞凋亡的作用,其诱导肿瘤细胞凋亡的作用发生在G2/M期,存在M-arrest (有丝分裂延缓)现象：吴茱萸碱联合靛玉红及其衍生物或R03306 (CDK1抑制剂)确实有协同杀伤作用。本研究将在这一基础上进一步探讨吴茱萸碱和CDK1抑制剂联合作用的M-arrest与M-slippage分子机制。阐明这一理论为肿瘤的临床用药提供科学依据,为进一步寻找更多针对细胞周期的中药成分和开拓以药物作用机制为靶点进行中药复方组合的理论打下基础,对传统中药的现代化具有深远的意义。二、研究方法1. Western Blot测定吴茱萸碱作用于人肝癌细胞株HepG2后cyclinB、cyclinE、 bax、bal-2等蛋白的表达；FCM法检测药物作用后不同时间点的细胞周期,从而确定M-slippage发生的时间点。2.Western Blot研究吴茱萸碱及CDK1抑制剂联合作用cyclinB、cyclinE等蛋白的表达变化：FCM法检测药物联合作用后不同时间点的细胞周期,从而确定药物联合后M-slippage发生的时间点。3.构建小鼠肝癌移植瘤模型,分模型组、紫杉醇组、吴茱萸组、青黛组、吴茱萸加青黛组、正常组,比较药效孰高孰低,探索加药方式、时间、加药量如何才能达到最大协同效应。三、研究结果1.吴茱萸碱单独作用对HepG2细胞的影响结果：FCM结果显示,2μmolL-1的吴茱萸碱分别作用后6、9、12、15、18、21、24h后,在6-15h中,G2/M期细胞百分含量逐渐升高,并在15h中达到高峰,。在15-24h中,G2/M期细胞百分含量逐渐下降,G1、S的细胞百分含量开始升高,而且凋亡率也开始升高。Western blot结果表明：同步化后不加药的HepG2细胞CyclinE蛋白表达在9h处出现首高峰,在12h处降低,之后又上升,18h时再一次出现高峰,到了21h时又下降；2 μmolL-1的吴茱萸碱分别作用细胞14、16、18、20、22h后, CyclinBl蛋白的表达在14h时处于最高峰,之后一直下降；2μmolL-1的吴茱萸碱分别作用后9、12、15、18、21h后,CyclinE蛋白的表达先在9h中出现高峰,然后下降,在15-21h中又重新上升,并在21h又出现表达高峰；CyclinBl先是在9-15h中逐步上升,在15h达到高峰,而后又开始下降,在21h中已经表达较少。2.紫杉醇联合CDK1抑制剂对HepG2细胞的影响结果：MTT结果显示PTX与R03306两者联合后能够明显提高肿瘤细胞抑制率,其中PTX (0.2μmol·L-1)与R03306(2μmol·L-1)联合后q值大于1.15,说明两者联合有协同性。FCM结果表明PTX能使细胞周期阻滞在G2/M期；随着PTX浓度升高,Gl期细胞减少,G2/M期细胞、凋亡率增加,且有浓度依赖性；R03306有一定S期或G2/M期阻滞作用,细胞凋亡率较低；PTX与R03306联合后对HepG2细胞凋亡率大于两者单独作用,且q值大于1.15,联合组随PTX浓度升高,G1期细胞减少,G2/M期细胞、死亡率增加,且有浓度依赖性,但死亡率的浓度依赖性不明显。Western Blot显示,与空白组相比,0.2μmol·L-1紫杉醇单独作用18h后,bcl-2蛋白水平明显下降,bax蛋白水平升高；Cyclin B1蛋白水平升高,cyclin E蛋白水平明显下降：2μmol·L-1 R03306单独作用6h, bcl-2蛋白水平明显下降,bax蛋白水平升高,Cyclin B1蛋白变化不大、Cyclin E上升；联合组(紫杉醇作用18h后加入R03306再共同作用6h)与对照组、紫杉醇组和R03306组比,bcl-2蛋白水平均明显下降,bax蛋白水平明显升高,而Cyclin B1蛋白的表达水平明显下降,Cyclin E表达水平与对照组比差别不大,但比紫杉醇组明显。3.吴茱萸碱联合CDK1抑制剂对HepG2细胞的影响结果：FCM结果表明EVO能使细胞周期阻滞在G2/M期；随着EVO浓度升高,G1期细胞减少,G2/M期细胞、凋亡率增加,且有浓度依赖性：R03306有一定S期或G2/M期阻滞作用,细胞凋亡率较低：EVO与R03306联合后对HepG2细胞凋亡率大于两者单独作用,且q值大于1.15,显示两者是协同性作用,联合组随EVO浓度升高,G1期细胞减少,G2/M期细胞、死亡率增加,且有浓度依赖性。Western blot结果显示2μmol·L-1 R03306单独作用6h,CyclinB1蛋白表达变化不大,而Cyclin E蛋白上升,。吴茱萸碱单药的3个浓度组CyclinB1的表达逐渐升高,呈浓度依赖关系,而Cyclin E的表达均比空白对照组和R03306组少。联合组3个浓度组中,Cyclin B1的表达均比对应的吴茱萸碱单药组要低,而Cyclin E的表达均则逐渐升高。4.动物实验结果：实验一：环磷酞胺组、联合序贯组以及联合反序贯组的抑瘤率分别为85.5%、80.5%、55.3%：各治疗组肿瘤质量均较模型对照组轻,环磷酞胺组与模型组比较有显著性差异(P<0.05),联合序贯组与模型组比较也有显著性差异(P<0.05),但联合反序贯组与模型组之间的比较均无显著性差异(P>0.05)。实验二：环磷酞胺组、吴茱萸组、青黛组、联合序贯组及联合反序贯组的抑瘤率分别为96.0%、68.7%、28.5%、65.4%、69.5%。各治疗组肿瘤质量均较模型对照组轻,环磷酞胺组与模型组比较有显著性差异(P<0.05),其他各组间两两比较结果及各组与模型组之间的比较均无显著性差异(P>0.05),但吴茱萸组、联合序贯组及联合反序贯组与模型组比较的p值分别为0.083、0.095和0.084,提示增加样本数量可能会达到显著性差异。四、结论吴茱萸碱诱导HepG2细胞实现M-arrest需要的时间大约是15h,进入不可逆凋亡的时间点大约是21h。吴茱萸碱诱导HepG2细胞凋亡与M-arrest维持时间及M-slippage事件的发生相关。吴茱萸碱与CDK1抑制剂R03306联合,能协同抑制HepG2细胞生长。其机制是吴茱萸碱首先实现细胞的M-arrest,加入R03306后,使细胞加快跳出M期,实现M-slippage,从而协同抑制细胞生长。动物实验证实中药吴茱萸与青黛联合后能够抑制小鼠肝癌移植瘤生长,且根据机制所采用的序贯联合用药的结果具有协同性。本研究为阐明中药复方药理探索新的研究方法,为提高中药临床药效和开发新的抗癌中药提供科学依据和参考。